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锌指蛋白A20在急性髓性白血病树突状细胞中的作用

作　者: 张晓颖
导　师: 陈虎
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 锌指蛋白A20 树突状细胞 急性髓性白血病 RNAi
分类号: R733.71
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


以树突状细胞（DCs）为基础的主动特异性细胞免疫治疗，在肿瘤患者的临床治疗中取得了初步和肯定的疗效。尤其是在急性髓性白血病（AML）的后续治疗中，它有效的针对并进一步消灭微小残余白血病灶（MRD），延长了患者化疗或移植后的缓解期。但是，正常细胞来源的DC存在数量较少，需要有效抗原负载等问题，在一定程度上临床应用受限，因此许多研究者致力于新的治疗策略的研发，其中就包括白血病肿瘤细胞诱导出的DCs（L-DCs）。目前分离比较成功的L-DCs主要是慢性髓性白血病细胞来源的DCs（CML-DCs）和急性髓性白血病细胞来源的DCs（AML-DCs），CML-DCs成熟度较好，并能有效的刺激同种异体T淋巴细胞反应，部分应用于了临床。但是AML-DCs的表型和功能则存在缺陷，并且分化不彻底，不成熟的AML-DCs容易诱导免疫耐受，在一定范围和程度中限制了其应用。锌指蛋白A20是一种具有泛素化修饰作用的酶，能通过限制NF-κB活性的方式来负向调节DCs的成熟、细胞因子的产生及免疫活性。但是A20和AML-DCs之间的关系到目前为止尚没有人做出评价。因此，本课题对于A20在AML-DCs中的作用及其机制做了研究和探讨，最终期望为AML患者针对MRD的个体化免疫治疗提供帮助。首先，利用AML初治患者外周血单个核细胞（PBMC）作为前体细胞，在常规DCs培养方法基础上进行了改进，诱导生成AML-DCs并分化成熟，同健康供者外周血单核细胞诱导的DCs在形态和表型上进行了比较和分析。结果表明，AML-DCs具有显微镜下典型的树突状细胞形态，CD80、CD83、CD86等DCs表面分子较健康人DCs表达较低，存在表型缺陷，并进一步影响其功能；融合基因检测证明其白血病来源。其次，根据锌指蛋白A20的基因结构特点，设计了3条siRNA来下调A20的表达。在转染试剂的作用下，我们将siRNA瞬转入AML-DCs，通过流式分析、实时定量PCR来进行检测。siRNA的转染效率较好，约为55%。siRNA转染后的AML-DCs，流式分析和实时定量PCR均证明A20被较好的下调表达，并且AML-DCs的成熟度得到了提高。再次，利用尼龙毛柱方法分离纯化同一患者缓解期外周血T细胞，使用IL-2维持T细胞的体外存活，通过显微镜下观察和流式分析发现，纯化后的T细胞高表达CD3和CD8，在低浓度的IL-2的维持下，T细胞能存活7天左右；将T细胞与A20下调表达的AML-DCs共培养后诱导CTLs过程中，细胞内因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-α、Gramzyme B和Perforin）和细胞外因子（IL-12p70、IL-6等）表达升高，表明AML-DCs的抗原递呈和免疫刺激能力均有所提高。流式分析和杀伤实验结果证实由A20下调表达的AML-DCs所诱导出来的CTLs特异性和杀伤性均较好。最后，对A20在AML-DCs中作用的信号通路进行了研究。根据锌指蛋白A20信号通路近期研究的相关文献，选择A20作用于NF-κB信号通路的上游和下游的关键蛋白（RIP、TRAF6和NF-κBp65），通过Western Blot对siRNA转染组和未转染组的AML-DCs进行关键蛋白检测，研究结果证实A20通过RIP和NF-κBp65在AML-DCs的诱导过程中来抑制NF-κB信号通路的激活。以上结果首次证明了锌指蛋白A20是AML-DCs成熟和功能的负向调控因子。A20下调表达能够使得AML-DCs表面的CD83、CD80和HLA-DR表达升高，抗原递呈和免疫刺激能力有所提高，能有效刺激T细胞活化为特异性的CTLs，能有效杀伤AML肿瘤细胞。这项研究结果为我们提供了一项以RNAi技术来抑制A20基因表达，得到增强的DCs疫苗抗AML肿瘤细胞免疫应答的新途径。

全文目录


英文缩略词  5-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-15
实验设计  15-16
第一部分 AML-DCs 诱导培养及性状研究  16-30
  实验流程  17-18
  材料和方法  18-22
  实验结果  22-27
  讨论  27-30
第二部分 siRNA 下调锌指蛋白 A20 基因的表达研究  30-52
  实验流程  31-32
  材料和方法  32-40
  实验结果  40-50
  讨论  50-52
第三部分 锌指蛋白 A20 下调表达的 AML-DCs 对于 T 细胞活化的影响  52-69
  实验流程  53-54
  材料和方法  54-59
  实验结果  59-66
  讨论  66-69
第四部分 AML-DCs 诱导的 CTLs 的功能检测  69-79
  实验流程  70-71
  材料和方法  71-74
  实验结果  74-77
  讨论  77-79
第五部分 A20 在 AML-DCs 作用的信号通路的机制研究  79-85
  实验流程  80-81
  材料和方法  81-83
  实验结果  83-84
  讨论  84-85
结论  85-86
参考文献  86-91
综述  91-100
  参考文献  97-100
附录 发表论著  100-110
个人简历  110-111
致谢  111

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病 > 急性白血病
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