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小鼠TERT启动子的克隆、活性鉴定及其调控基因的表达

作　者: 梁爽
导　师: 华会明; 吴久鸿; 司少艳
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 天然药物化学
关键词: 肿瘤 TERT启动子基因治疗葡萄球菌肠毒素A CD80
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

肿瘤是严重威胁人类健康的常见病和多发病,有报道显示,肿瘤的死亡率仅以微小差别略低于心脑血管疾病成为第二大威胁人类生命的疾病。传统的抗肿瘤药物大多是些细胞毒类物质,而这类药物往往无选择性,对正常组织、细胞毒性较大,且易产生耐药,这就促使人们不断的开发高效、低毒、特异性强的新型抗肿瘤药物。近年来,随着分子生物学、分子遗传学、免疫学等相关学科的发展和渗透,使肿瘤基因治疗技术迅速发展,一些基因水平的靶向抗肿瘤药被陆续开发出来,至此,肿瘤的基因治疗以其独有的优势成为人们研究的热点。端粒酶(telomerase)是一种能够催化延长端粒末端的核糖核蛋白(RNP),由端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白和端粒酶逆转录酶(TERT)组成,而TERT是决定端粒酶活性最主要的因素。由于TERT在大部分正常组织细胞中不表达,而在大部分肿瘤细胞中显示为高表达,因此,采用端粒酶启动子调控目的基因的表达,常被用来作为肿瘤靶向基因治疗的策略。目前,人的TERT启动子转录活性区域研究得比较清楚,而小鼠TERT (mTERT)启动子转录活性区域还不十分明确。葡萄球菌肠毒素A(SEA)是一种强大的免疫激活剂,它无需抗原提呈细胞的加工处理,而是以完整的蛋白形式结合于MHC-Ⅱ类分子沟槽外侧,激活大量的T细胞,同时产生大量的细胞因子,如TNF-α、IL-2、IFN-γ等,从而产生抗肿瘤效应。SEA诱导的T细胞活化需要TCR和CD28介导的活化信号的共同参与。而CD80是能够与CD28分子结合的共刺激分子之一,它与T细胞表面CD28分子的结合为T细胞有效活化提供第二信号。因此,本研究克隆不同长度的mTERT启动子片段,研究其在多种肿瘤细胞和正常细胞中的活性,明确mTERT的核心启动子区；以SEA和CD80基因作为治疗基因,以mTERT的核心启动子区作为SEA和CD80基因的调控元件,构建真核表达载体,并观察其在肿瘤细胞和在正常细胞中的表达情况,为肿瘤靶向基因治疗提供实验材料和理论依据。1.mTERT启动子的克隆及在多肿瘤细胞中的活性研究目的：明确小鼠TERT启动子的核心区,并作为肿瘤基因治疗中目的基因的调控元件。方法：提取Hepal-6细胞的基因组DNA,并以此为模板,采用PCR方法扩增1086bp的mTERT启动子片段,命名为mTERT1,胶回收PCR产物,经XhoⅠ和NcoⅠ双酶切后,克隆入pGL3-Basic载体,构建重组质粒pGL3-mTERT1;再以质粒pGL3-mTERT1为模板,PCR扩增不同长度的mTERT启动子片段,采用同样的方法克隆入pGL3-Basic载体,分别命名为pGL3-mTERT2至7,采用LipofectamineTM2000脂质体分别将质粒pGL3-mTERT1至7与pRL-CMV瞬时共转染小鼠肿瘤细胞Hepal-6、B16、CT26和正常细胞NIH3T3细胞,采用双荧光素酶的方法检测不同mTERT启动子片段在细胞中的活性,以pGL3-Control的活性为1, pGL3-mTERT重组质粒的荧光素酶活性与pGL3-Control的活性的比值为mTERT启动子片断在各细胞中的相对转录活性。最后通过比较各个片段的转录活性确定小鼠TERT启动子的核心区,并作为肿瘤基因治疗中目的基因的调控元件。结果：克隆的不同长度的mTERT启动子片断,经测序显示与GenBank中公布的序列完全一致；在Hepal-6,B16和CT26细胞的转录活性远高于NIH3T3细胞,mTERTl至5的相对转录活性远高于mTERT6和mTERT7,其中mTERT5相对转录活性较高,而mTERT6和mTERT7则几乎为零,不同细胞的相对转录活性略有差别。结论：在不同长度的mTERT启动子片段中,mTERT5为其核心启动子区,作为下一步肿瘤靶向基因治疗中目的基因的调控元件。2.mTERT启动子调控的SEA、CD80基因共表达鉴定目的：构建mTERT5调控的SEA/CD80基因真核共表达载体,并鉴定其SEA和CD80在肿瘤细胞中的表达情况。方法：用XbaⅠ和BglⅡ双酶切本实验室保存的PMD18-BIS质粒,将胶回的收目的片段(SEA+IRES+CD80)插入已构建好的pGL3-mTERT5载体中,构建真核表达载体pGL3-m5-BIS。采用脂质体LipofectamineTM2000将质粒pGL3-m5-BIS体外瞬时转染小鼠Hepal-6、B16、CT26和NIH3T3细胞,提取RNA,采用RT-PCR方法检测SEA和CD80 mRNA在细胞中的表达情况；采用抗SEA抗体(FITC标记)和抗小鼠CD80抗体(PE标记)进行免疫荧光染色,并观察SEA和CD80在细胞中的表达情况。结果：酶切鉴定显示载体构建成功；RT-PCR结果显示,转染pGL3-mTERT5-BIS质粒的Hepal-6、B16和CT26细胞,SEA和CD80 mRNA有较高水平的表达,而转染pGL3-mTERT5-BIS质粒的NIH3T3细胞只有SEA和CD80 mRNA的微弱表达；免疫荧光染色结果显示：SEA和CD80能够在小鼠Hepa1-6, B16和CT26细胞膜上共表达,但在NIH3T3细胞中则不表达。结论：成功构建了mTERT调控的SEA/CD80基因真核共表达载体,使SEA/CD80能够在Hepa1-6、B16和CT26细胞膜上共表达,在NIH3T3细胞膜上不表达。本研究明确了小鼠mTERT核心启动子区为mTERT5,在此基础上构建了mTERT5调控的SEA/CD80基因共表达载体pGL3-mTERT5-BIS,可以使SEA和CD80能够在Hepa1-6, B16和CT26细胞膜上共表达,但在NIH3T3细胞中不表达。本研究为下一步肿瘤的靶向基因治疗提供了实验材料和理论依据。

全文目录

缩略语表  8-9
中文摘要  9-12
英文摘要  12-16
第1章前言  16-26
  1.1 端粒和端粒酶  16-18
  1.2 TERT启动子及其转录调控机制  18-22
  1.3 TERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗  22-26
第2章 mTERT启动子的克隆及在多肿瘤细胞中的活性研究  26-47
  2.1 实验材料及仪器  26-30
  2.2 实验方法  30-32
  2.3 实验结果  32-45
  2.4 讨论  45-47
第3章 mTERT启动子调控的SEA、CD80基因共表达鉴定  47-58
  3.1 实验材料及仪器  47
  3.2 实验方法  47-50
  3.3 实验结果  50-56
  3.4 讨论  56-58
小结  58-59
参考文献  59-65
致谢  65

小鼠TERT启动子的克隆、活性鉴定及其调控基因的表达

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