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L1编码蛋白在肿瘤中功能的初步研究

作　者: 胡明明
导　师: 朱运峰; 于继云
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 肿瘤学
关键词: L1 ORF1p 蛋白纯化多克隆抗体肿瘤
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在基因组内存在着为数众多并能进行移动DNA元件。其中一类是需要经过RNA介导的,称为反转座子(或逆转座子)。由于RNA聚合酶和逆转录酶均无校对功能,就使得逆转座子具有高度变异性。分散在真核生物基因组中的大量逆转座子是基因组不稳定的因素,它们可引起基因序列的删除、扩增、倒位、移位、断裂等异常。LINEs(long interspersed nuclear elements),即长散布核元件,是反转座子家族中最主要成员, LINE-1 (L1)占人类基因组的17%,在人类基因组中获得多达十万份的拷贝数,其中95%以上为5’端缺失,其中10%还存在重排,因此具有序列转座活性的全长L1很少(80-100拷贝)。L1是进化上保守的一个超基因家族,含有两个开放读码框(open reading frame,ORF)即ORF1和ORF2。ORF2编码一个146KD的蛋白,该蛋白具有核酸内切酶和逆转录酶两种活性,ORF1蛋白是目前发现的唯一一种与已知蛋白没有任何同源性的分子,目前对其认识仅限于这个蛋白能优先结合自身RNA,形成核酸蛋白复合体,与ORF2p一起参与逆转座过程。研究发现,在细胞中ORF1p和ORF2p的表达具有极大的不协调性,ORF1p过量于ORF2p千倍以上,提示ORF1p可能具有其它功能。其转座机制为TPRT(Target primed reverse transcription),即全长L1转录本由细胞核进入细胞质,翻译为转座必需的蛋白质ORF1p和ORF2p,同时这两个蛋白与L1转录本形成核蛋白体复合物,再次进入细胞核,由ORF2p所具有的内切酶功能识别并切割靶位点产生3′OH ,然后由ORF-2p所具有的逆转录酶功能以L1RNA为模板,从切割位点的3′-OH开始引发进行反转录,合成L1-DNA ,新合成的DNA右端与染色体DNA相连,完成转座。研究发现,在几乎所有的肿瘤细胞中L1呈激活状态,且在多种肿瘤细胞中检测到了ORF1p,而在癌旁组织和正常组织中ORF1p表达水平很低或检测不到。故我们认为L1-ORF1蛋白为肿瘤特异表达产物,其联合其它癌基因(蛋白)的检测将为癌症的临床诊断、治疗效果监测和预后提供有重要指标。对于研究一个功能未知的蛋白而言,其抗体的制备工作是至关重要的。基于上述相关背景,我们开展了本课题的研究。本部分实验包括三个部分,即原核表达载体pGEX/L1-ORF1的构建和表达纯化,多克隆抗体制备及鉴定和ORF1p功能的初步探索。在第一部分中,我们选取了原核表达载体pGEX-6P-1,该载体带有IPTG诱导启动子,并且带有GST标签序列,融合蛋白产物可通过GST层析柱可以快速、简便的纯化。通过分子克隆的方法,我们把ORF1基因克隆入此载体,构建了pGEX/L1-ORF1重组表达载体,并通过对表达条件如温度、IPTG浓度、诱导时间等条件的摸索,最终选择IPTG0.2mM,37℃,诱导4h为最优的表达条件,用亲和层析的方法的得到了重组蛋白,并通过SDS-PAGE和Western-blot的方法对其鉴定。在第二部分试验中我们首先将此重组蛋白对兔进行免疫,分离血清,制备了兔抗ORF1p的多克隆抗体。用ELISA的方法,对制备的抗体进行效价检测。然后我们以制备的兔抗L1-ORF1多克隆抗体作为一抗,用Western-blot的方法,分别检测原核表达的目的蛋白和转染ORF1的293细胞,均检测到特异性条带。同时用间接免疫荧光方法直观地观察到了转染的目的蛋白在细胞中的分布,结果显示在细胞核和细胞质中均有表达,这与目前的文献报道是一致的。然后我们以兔抗L1-ORF1多克隆抗体作为一抗,用免疫组化方法观察了四例肝癌患者石蜡切片中的ORF1p的表达情况,并以正常肝组织作为对照,显示在癌组织切片有ORF1p的阳性表达,而在正常肝组织中则未检测到该蛋白。在第三部分实验中,我们对ORF1p进行与自身RNA的体外结合试验,在此过程中,我们用体外转录的方法得到了ORF1和ORF2的转录RNA,并分别与ORF1p共孵育,通过琼脂糖凝胶电泳的方法检测ORF1p与核酸的相互作用,初步显示ORF1p具有结合单链核酸的功能。已完成的部分实验数据证实:在肿瘤细胞中下调L1-ORF1表达,能够减缓多种肿瘤细胞生长,造成转染肿瘤细胞的细胞周期阻滞在S期,过表达L1-ORF1,则得到相反的结果,同时我们还发现多种含有终止密码的L1序列突变体则失去其促增殖作用。有研究显示在多种肿瘤细胞株中使用逆转录酶抑制剂或者RNA干扰技术介导LI序列沉默能减慢细胞增殖并且诱导细胞分化,在动物实验中也得到了一致的结论。此研究为抗肿瘤药物的开发和肿瘤的早期发现、诊断和治疗提供新的分子靶点。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-11
第一部分原核表达载体pGEX/L1-ORF1 的构建和表达纯化  11-21
  材料与方法  11-16
  结果  16-20
  讨论  20
  参考文献  20-21
第二部分多克隆抗体制备和特异性鉴定  21-33
  材料与方法  21-26
  结果  26-31
  讨论  31-32
  参考文献  32-33
第三部分 ORF1p 功能的初步探索  33-39
  材料与方法  33-36
  结果  36-37
  讨论  37-38
  参考文献  38-39
致谢  39-41
附录1：英文缩略词表  41-42
附录2 硕士期间发表文章  42-43
附录3 文献综述  43-53
附录4 发表论著  53-59
附录5 个人简历  59

L1编码蛋白在肿瘤中功能的初步研究

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