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pp32/PHAPI调控肿瘤细胞迁移的作用研究

作　者: 程倩
导　师: 吴祖泽；崔春萍
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: ]磷蛋白32 细胞迁移 肝癌细胞 前列腺癌细胞
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的意义:磷蛋白32(phosphoprotein 32,pp32)是Malek等于1990年首次发现的,pp32是富含亮氨酸的酸性核蛋白(Leucine-rich acidic nuclear protein,LANP)家族成员之一。LANP家族成员包括pp32、PHAPI、Mapmodulin、I1PP2A、APRIL、HPPCn、pp32r1和pp32r2等。pp32由两个结构域组成,N端为5个亮氨酸组成的LRRs(Leucine-rich repeats)结构,是一个公认的蛋白间相互作用的构象。C端则是一个天冬氨酸和谷氨酸含量很高的酸性尾巴。伸展的C末端尾巴和三维构象为球形的N端LRRs区,整个蛋白结构类似一只蝌蚪。在C端的酸性区域中有一个典型的核定位信号NLS(nuclear localization signal)KRKR,是其行使核质穿梭行为的重要结构基础。pp32是一个多功能的蛋白质,它涉及到很多生理过程,包括细胞增殖、凋亡、mRNA运输和转录。由于pp32已经被分离出过很多次,所以又被冠以不同的名称:pp32 (phosphoprotein 32)、Anp32a(acidic nuclear phosphoprotein32a)、PHAPI(putative HLA- associated protein I)、mapmodulin、Lanp(leucine-rich nuclear protein)和I1PP2A(inhibitor 1 protein phosphatas 2A)等。目前对pp32的功能研究主要集中在以下几个方面:(1)能够抑制多种原癌基因(如ras、E1a、mutant p53和myc等)在大鼠成纤维细胞中的恶性转化。(2)促进人子宫颈癌细胞Hela和人乳腺癌细胞HMECs的凋亡。(3)抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性。(4)作为mRNA结合蛋白HuR的配体,影响HuR蛋白的核质穿梭,参与mRNA的稳定性。(5)作为乙酰转移酶抑制剂(INHAT)的组成部分,参与调控组蛋白乙酰化和磷酸化过程,调控染色体结构。(6)参与细胞骨架动力学。(7)参与细胞内物质运输及信号传递。(8)参与组织发育。一些研究表明,经低氧处理72h后,HepG2和Huh7细胞(它们与上皮细胞具有典型的相似性,并拥有发育良好的细胞连接)获得了梭形表型并普遍失去了细胞连接。为了进一步测定在低氧条件下HepG2和Huh7细胞的形状改变是否意味着EMT(上皮-间质转化),我们鉴定出相对于通常表型的HepG2细胞,过表达pp32的HepG2细胞形状发生改变。我们推测pp32会影响肿瘤细胞的运动及迁移能力。肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞离开原来部位,通过血液循环或淋巴系统,到达其他部位并继续生长,形成新病灶的全过程。此新病灶称为转移灶,原来的肿瘤称原发灶。大多数肿瘤都具有转移性,这是临床上治愈肿瘤患者的主要障碍。肿瘤细胞获得侵润、播散,并在转移部位存活下来这一复杂的过程受基因和细胞两种水平的调节。pp32与肿瘤转移之间的关系研究,很可能为以后的基因治疗提供有用的线索。本课题主要进行以下两方面的研究:1、pp32抑制肝癌细胞的迁移特性2、pp32影响Pc3M细胞的迁移特性材料与方法:利用western blots实验检测pp32在HepG2、SMMC7721、MHCC 97H、SK-hep1、MSC、和Ad-293等15种细胞中的表达。为了鉴定pp32在肝癌细胞迁移中的作用,我们将本实验室先前构建的HepG2-pcDNA3.1和HepG2-pcDNA3.1-pp32细胞株复苏,用800μg/ml的G418筛选三周后,再用400μg/ml的G418维持培养。Transwell小室实验检测细胞迁移能力,黏附测定实验检测细胞黏附能力。克隆形成率实验检测细胞增殖能力,用流式细胞仪检测细胞凋亡。并检测vinculin在HepG2、HepG2-pcDNA3.1和HepG2-pp32细胞中的表达。随后,利用尾静脉注射细胞实验在裸鼠体内初步检测了pp32对HepG2细胞迁移能力的影响。用裸鼠皮下移植瘤实验鉴定pp32在裸鼠体内对HepG2细胞增殖的影响。另外,由于有研究发现,在前列腺癌中有pp32突变体(pp32r1和pp32r2)的存在,我们鉴定了pp32对高转移的前列腺癌细胞系Pc3M的影响。我们将本实验室先前保存的pcDNA3.1和pcDNA3.1-pp32菌液,摇菌,提取质粒后,将pcDNA3.1和pcDNA3.1-pp32质粒转染至Pc3M细胞,48小时后用700μg/ml的G418筛选三周,构建Pc3M-pcDNA3.1和Pc3M-pcDNA3.1-pp32稳定细胞株。Pc3M-pcDNA3.1和Pc3M-pcDNA3.1-pp32细胞用350μg/ml的G418维持培养。我们在体外鉴定了pp32对Pc3M细胞形状变化、迁移、黏附和增殖等特征的影响。实验结果:Western blots实验表明,pp32在15种细胞中均有表达。pp32过表达能够降低HepG2细胞的迁移和黏附能力。pp32能够抑制HepG2细胞中vinculin的表达。体内初步实验发现,pp32在裸鼠体内可能具有抑制HepG2细胞迁移的作用。相对于HepG2-pcDNA3.1细胞,HepG2-pp32细胞在裸鼠腋下所成的肿瘤大小无明显差异。获得了稳定过表达pp32的Pc3M细胞株(Pc3M-pp32),pp32引起Pc3M细胞的形状改变,但不影响其恶性表型。pp32还引起人前列腺癌细胞Pc3M的迁移和黏附能力增加。pp32在HepG2和Pc3M细胞迁移中的作用是不同的,这非常有意思并为我们的研究带来了挑战。结论与分析:pp32是一个多功能的蛋白质,它不仅作为一个核蛋白发挥作用,而且有时还定位在细胞质中发挥作用。它不仅参与组织发育、信号转导、转录调控和其它多种生理过程,还能促进细胞凋亡、抑制肿瘤生长、抑制PP2A活性和具有其它功能。pp32能够抑制肝癌细胞HepG2的迁移特性,pp32能够促进Pc3M细胞的迁移。对pp32调控肿瘤细胞迁移的研究,不仅有利于肿瘤生物学的发展,而且有助于为人类肿瘤疾病寻找新的治疗途径。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤病理学、病因学
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