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抑癌基因PTEN对DNA修复基因RAD51的调控作用及其机制和PTEN在染色质重塑中的作用

作　者: 陈忠民
导　师: 周平坤; 吴德昌
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 卫生毒理学
关键词: PTEN RAD51 FOXO3a PI3K/AKT信号通路染色质重塑 DNA损伤
分类号: R730.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

PTEN（Phosphatase and TENsin homolog deleted on chromosome 10）是1997年Li等三个实验室分别发现的抑癌基因,也是目前发现的唯一同时具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性的抑癌基因。在目前已知的肿瘤细胞中多数都有PTEN的缺失或突变,其突变频率与P53相当。细胞在受到外源或内源性基因毒作用,特别是电离辐射时会发生DNA双链断裂（DNA double-strand break, DSB）,修复这种DNA损伤主要由两种途径:非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）和同源重组（homologous recombination,HR）。参与同源重组的基因中最重要的基因是RAD51。本实验室前期研究发现PTEN缺失可导致RAD51表达下降,自发性DNA断裂增多。目前有关PTEN对RAD51调节作用的报道比较少,且观点不一。本研究在实验室前期的研究基础上深入探讨PTEN对RAD51的调节作用及其机制。为了有效地发挥DNA损伤修复和细胞周期检查点的功能,必须使凝聚的异染色质打开,促进修复蛋白接近DNA损伤位点,这种染色质结构的改变称之为染色质重塑。染色质重塑在DNA复制、损伤修复和基因转录中发挥着重要的作用。目前有关染色质重塑的研究较少,主要是研究方法的限制。本研究利用大规模染色质重构AO3₁细胞模型,通过融合绿色荧光蛋白的技术,直观地观察目标蛋白是否具有染色质重塑功能。本研究首次发现PTEN具有染色质重塑功能,并在此基础上研究了PTEN各结构域及C端磷酸化位点在染色质重塑中的作用,从蛋白质复合物角度探讨了PTEN参与染色质重塑的机制。取得以下进展:1.中性单细胞电泳和免疫荧光方法发现:与PTEN野生型细胞相比,PTEN缺失细胞的尾力矩增大,细胞内自发性γ-H2AX foci数增多,γ射线照射后增加更加明显（p<0.01）。实验表明PTEN缺失导致细胞基因组稳定性明显下降。2. PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002处理PTEN缺陷型细胞,实时定量PCR检测发现RAD51表达上调,初步证明PI3K/AKT信号通路是PTEN调节RAD51表达的方式之一。向PTEN野生型细胞转染野生型AKT（AKT WT）或组成型激活AKT（AKT AC）后发现RAD51表达下调;向PTEN缺陷型细胞转染野生型PTEN（PTEN WT）或失去激酶活性AKT（AKT DN）后发现RAD51表达上调;SiRNA技术沉默PTEN缺陷型细胞中的AKT基因发现RAD51表达上调。上述数据证明PI3K/AKT信号通路确实参与PTEN对RAD51的调节作用。3. FOXO3a是PI3K/AKT信号通路下游底物之一。我们利用生物信息学软件Signal scan和TFSEACH软件分析RAD51基因的启动子区发现FOXO3a是RAD51潜在的启动子,并使用双荧光素酶报告系统初步证明了这一点。Western印迹检测发现PTEN缺陷型细胞核蛋白FOXO3a的磷酸化水平增高。PTEN缺陷型细胞转染PTEN WT或AKT DN后细胞核蛋白FOXO3a的磷酸化水平下降,PTEN野生型细胞转染AKT WT或AKT AC后细胞核蛋白FOXO3a磷酸化水平增高,沉默FOXO3a后发现RAD51在蛋白和mRNA水平表达均有所降低。综合上述结果我们提出PI3K/AKT/FOXO3a信号通路是PTEN调节RAD51表达的方式之一。4.首次发现PTEN可以参与染色质重塑,该功能依赖于PTEN蛋白氨基端的磷酸酶活性,C末端（C2结构域、PDZ结构域和C2+PDZ）有抑制作用。PTEN S380磷酸化以及K402乙酰化是PTEN参与染色质重塑重要的调节位点。5.蓝色温和胶联合质谱技术,首次发现一系列与PTEN相互作用的蛋白,包括:H2、H3、H4和Chk2等。Western印迹证实PTEN确实可以与γ-H2AX、Chk2相互作用,提示PTEN可能参与了DNA损伤修复的早期识别,或通过被Chk2磷酸化从而参与DNA损伤修复或细胞周期调控。本研究首次发现PTEN可以通过PI3K/AKT/FOXO3a信号通路调节RAD51的表达,PTEN可以依赖其蛋白磷酸酶活性参与染色质重塑,为更好的理解PTEN与肿瘤发生发展的关系,同时为肿瘤防治提供实验依据和可能的药靶。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
前言  10-19
  参考文献  15-19
第一部分 PTEN 通过抑制PI3K/AKT 通路上调RAD51 表达  19-46
  1. 实验材料与方法  19-32
  2. 实验结果  32-42
  3. 讨论  42-44
  参考文献  44-46
第二部分 FOX03a 介导PTEN 对DNA 修复基因RAD51 表达的调节作用  46-58
  1. 实验材料与方法  46-51
  2. 实验结果  51-55
  3 讨论  55-56
  参考文献  56-58
第三部分 PTEN 在染色质重塑中的作用  58-78
  1. 实验材料与方法  58-66
  2. 实验结果  66-74
  3. 讨论  74-76
  参考文献  76-78
第四部分 PTEN 参与染色质重塑机制初探  78-94
  1. 实验材料与方法  78-83
  2. 实验结果  83-89
  3. 讨论  89-92
  参考文献  92-94
全文结论  94-96
附录Ⅰ 缩略词表  96-98
附录Ⅱ 综述  98-106
  参考文献  103-106
附录Ⅲ 发表文章  106-117
个人简历  117-118
致谢  118

抑癌基因PTEN对DNA修复基因RAD51的调控作用及其机制和PTEN在染色质重塑中的作用

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