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Spindlin1与Aurora-A激酶相互作用的研究

作　者: 王静雪
导　师: 裴雪涛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业:
关键词: Spindlin1 Aurora-A Wnt/TCF-4 信号通路细胞增殖磷酸化
分类号: R730.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

恶性肿瘤是严重危害人们健康生活的疾病，死亡率居高不下，寻求新的肿瘤相关基因，具有重要的理论与社会意义。在早期研究中，我们对人卵巢癌相关基因进行了筛选和研究，克隆、鉴定并命名了人Spindlin1基因，该基因与小鼠spindlin基因高度同源，同属于Spin/Ssty基因家族。Spin/Ssty基因家族被证实参与配子发生过程，并在早期胚胎中检测到其表达。在进一步的研究中，我们发现Spindlin1定位于细胞核，过表达Spindlin1的NIH3T3细胞不仅具有明显的克隆形成和迁移能力，并且能使裸鼠成瘤。之后，我们又证明过表达Spindlin1会导致细胞出现多核，G2/M期细胞阻滞，纺锤体组装异常，有丝分裂灾变及基因组不稳定等现象。以上研究结果提示我们：Spindlin1在肿瘤的发生发展中扮演重要角色。但是，对于Spindlin1发挥其生物学作用的分子机制仍尚未明了。Aurora-A激酶属于Ser/Thr激酶，是Aurora激酶家族的重要成员，该激酶家族主要在中心体成熟分离和胞质分裂过程中扮演重要角色。目前已报道Aurora-A激酶在多种类型肿瘤细胞中具有高水平表达，并且在50%以上的卵巢癌和乳腺癌中发现Aurora-A激酶的表达水平明显上升，并伴随其激酶活性的增强。Aurora-A激酶表达异常会破坏细胞周期多个检测点功能，导致纺锤体组织异常及胞质分离异常，最终形成非整倍体细胞，与肿瘤发生过程密切相关。Aurora-A激酶参与多种肿瘤相关信号通路的调控，近年来对Aurora-A激酶及其作用底物在肿瘤发生中的作用机制已成为研究热点，但关于Aurora-A激酶调控的下游分子更为详细的作用机制仍有许多不为人知。对其新的作用底物不断研究发现的过程，为我们研究肿瘤药物靶向分子提供了新的思路。我们的前期研究发现，Spindlin1表达异常时与Aurora-A激酶过度表达产生的细胞有丝分裂期阻滞，纺锤体组织紊乱，多核等诸多现象存在相似之处，除此之外两者在有丝分裂期亚细胞定位上也有类似的纺锤体分布定位，这些信息提示我们二者在时空上存在相互作用的可能性。此外，我们之前在对Spindlin1的三维晶体结构研究中，发现Spindlin1的结构分为三个序列上非常类似的重复结构域，存在磷酸根配体的结合位点，意味着磷酸化修饰可能对Spindlin1发挥生物学功能起着重要作用。以上现象使我们有理由推测：Spindlin1可能是Aurora-A激酶新的作用底物，受到其作用而发生磷酸化修饰变化；Aurora-A激酶的磷酸化作用有可能对Spindlin1生物学功能的发挥产生重要作用。为了验证我们的假设，在本课题中我们进一步明确Spindlin1的生物学功能，并在此基础上展开Spindlin1与Aurora-A激酶相互作用的研究。首先，为研究Spindlin1对肿瘤细胞增殖的影响，我们利用慢病毒包装系统筛选出稳定外源表达Spindlin1的几株单克隆肿瘤细胞株，用克隆形成、CCK-8及裸鼠成瘤实验从体外和体内水平证明了Spindlin1能促进肿瘤细胞的增殖能力。其中Spindlin1能够使肿瘤细胞的克隆形成能力增至1.7-3.1倍，并导致裸鼠成瘤的质量增长至2.4倍。同时，我们将合成的小分子干扰RNA（siRNA）瞬时转染到肿瘤细胞中，降低内源性Spindlin1的表达，进行克隆形成和CCK-8细胞增殖实验，证明Spindlin1表达量降低之后，肿瘤细胞的生长速度也受到抑制，克隆形成能力降低46%。其次，在利用Millicell进行的体外侵袭实验中，我们证明了Spindlin1过表达会导致肿瘤细胞的侵袭能力增至3倍。最后，我们用Hoechst33258对细胞核进行染色，统计凋亡细胞比例，证明了过表达Spindlin1会少量促进肿瘤细胞凋亡，但作用并不十分显著。以上实验结果证明了Spindlin1的癌基因特性。然后，我们对Spindlin1与Aurora-A激酶之间的相互作用进行了验证。我们先通过免疫荧光染色，观察到Spindlin1和Aurora-A激酶在细胞有丝分裂间期定位于中心体，在有丝分裂前期到末期定位于纺锤体两极，证明Spindlin1和Aurora-A激酶存在有丝分裂亚细胞共定位。随后我们通过GST-Pulldown实验和Co-IP实验分别从体外和体内证明Spindlin1与Aurora-A激酶存在直接的相互作用。接着我们用体外激酶实验证明Spindlin1能够被Aurora-A激酶磷酸化，并进一步通过构建Spindlin1截短体和突变体进行体外激酶实验，证明Aurora-A激酶磷酸化Spindlin1Ser84位和Ser99位。最后，为观察Spindlin1磷酸化位点对其生物学功能的影响，我们构建了Spindlin1Ser84/99Ala联合突变体，进行克隆形成、CCK-8和裸鼠成瘤实验，证明了Spindlin1磷酸化位点突变会降低其对肿瘤细胞增殖的促进作用，即磷酸化位点修饰变化与Spindlin1的生物学功能相关。其中磷酸化位点突变使肿瘤细胞的克隆形成能力降低43%，并导致裸鼠成瘤的质量降低69%。以上结果证明：Spindlin1是Aurora-A激酶新的作用底物，磷酸化位点是Ser84和Ser99位，这两个位点的磷酸化对于Spindlin1维持其生物学功能是不可或缺的。在确认Spindlin1是Aurora-A激酶新的作用底物，并验证Spindlin1磷酸化位点对维持其功能的作用之后，我们开始思考被Aurora-A激酶磷酸化的Spindlin1是通过何种途径发挥其对肿瘤生长的促进作用呢？前期的预实验表明Spindlin1可能与在肿瘤发生发展中发挥重要调控作用的Wnt/TCF-4信号通路相关，因此在本部分实验中我们以TCF-4为切入点展开对Spindlin1作用机制的研究。首先我们用GST-Pulldown证明了Spindlin1与TCF-4在体外存在直接相互作用，之后又利用TCF/β-catenin报告载体——pTOPFlash，通过双荧光素酶检测系统证明Spindlin1能够促进Wnt/TCF-4通路活性1.6-3.6倍。另外我们还选取了对细胞增殖及细胞周期具有调控作用的Wnt/TCF-4信号通路的下游信号分子c-Myc和Cyclin D1作为研究对象，通过RT-PCR和Western blot的方法证明Spindlin1的过表达会促进这些信号分子在mRNA水平和蛋白水平的表达，这些结果表明Spindlin1可能通过Wnt/TCF-4信号通路发挥生物学作用。为进一步验证Spindlin1对Wnt/TCF-4信号通路的促进作用与其磷酸化位点的关系，我们用稳定表达Spindlin1Ser84/99Ala联合突变体的肿瘤细胞重复以上Spindlin1对Wnt/TCF-4信号通路作用的实验后发现，Spindlin1突变体与TCF-4直接相互作用减弱，对Wnt/TCF-4通路活性无促进作用，并且导致Spindlin1对信号通路下游信号分子表达的促进作用也大大降低。以上结果证明：Spindlin1促进Wnt/TCF-4信号通路活性，其磷酸化位点在此过程中发挥关键性作用。综上所述，Spindlin1对肿瘤细胞增殖有明显的促进作用，它是Aurora-A激酶新的作用底物，Aurora-A激酶磷酸化Spindlin1位点Ser84和Ser99从而激活其生物学活性，随后Spindlin1通过激活Wnt/TCF-4信号通路发挥其对肿瘤细胞增殖的促进作用。

全文目录

缩略词表 (Abbreviations)  7-9
摘要  9-13
Abstract  13-17
前言  17-23
第一章 Spindlin1 的生物学功能研究  23-51
  第一节 Spindlin1 促进肿瘤细胞增殖  24-38
    材料与方法  24-32
    实验结果  32-37
    讨论  37-38
  第二节 Spindlin1 促进肿瘤细胞侵袭  38-45
    材料与方法  38-41
    实验结果  41-43
    讨论  43-45
  第三节 Spindlin1 对肿瘤细胞凋亡的影响  45-51
    材料与方法  45-47
    实验结果  47-49
    讨论  49-50
    结论  50-51
第二章 Spindlin1 与 Aurora-A 激酶相互作用  51-82
  第一节 Spindlin1 与 Aurora-A 激酶在有丝分裂期共定位  52-56
    材料与方法  52-54
    实验结果  54-55
    讨论  55-56
  第二节 Spindlin1 与 Aurora-A 激酶在体外、体内相互作用  56-68
    材料与方法  56-63
    实验结果  63-66
    讨论  66-68
  第三节 Aurora-A 激酶磷酸化 Spindlin1 Ser84 和 Ser9962  68-74
    材料与方法  68-71
    实验结果  71-72
    讨论  72-74
  第四节磷酸化位点突变影响 Spindlin1 生物学功能  74-82
    材料与方法  74-77
    实验结果  77-80
    讨论  80-81
    结论  81-82
第三章磷酸化 Spindlin1 通过激活 Wnt/TCF-4 信号通路促进肿瘤细胞增殖  82-102
  第一节 Spindlin1 与 TCF-4 相互作用并激活 Wnt/TCF-4 信号通路  83-90
    材料与方法  83-86
    实验结果  86-88
    讨论  88-90
  第二节 Spindlin1 促进 Wnt/TCF-4 下游信号分子表达  90-95
    材料与方法  90-92
    实验结果  92-93
    讨论  93-95
  第三节磷酸化位点突变影响 Spindlin1 对 Wnt/TCF-4 信号通路的激活作用  95-102
    材料与方法  95-97
    实验结果  97-99
    讨论  99-101
    结论  101-102
总结与展望  102-103
参考文献  103-110
附录  110-111
  主要仪器  110-111
与学位论文相关的该研究领域文献综述（全文）  111-118
  参考文献  115-118
在学期间发表的代表性论著（全文）  118-129
个人简历  129-130
致谢  130-131

Spindlin1与Aurora-A激酶相互作用的研究

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