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TEM8与uPA的相互作用及其生物学意义研究

作　者: 张连成
导　师: 陈惠鹏; 胡显文
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: TEM8 uPA 相互作用磷酸化
分类号: R73-3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

血管生成是从组织中已存在的成熟血管发展形成新的毛细血管网络的过程，在包括胚胎发育、伤口愈合、组织再生和重塑等许多重要的生理过程是必不可少的。然而失控的或有缺陷的血管生成也存在于各种疾病，包括肿瘤、心血管疾病以及增生性视网膜疾病的病理过程中。靶向血管生成疗法可以被用来终止或延缓这些疾病的发展，所以这种治疗方法已经引起了科学界极大的关注。然而在临床应用中靶向血管生成的抗肿瘤药物被证明只有有限的疗效，同时还存在很大的副作用，于是寻找更特异性的血管生成标志物变得更加迫切。肿瘤内皮标志物Ⅷ(tumor endothelial marker8，TEM8)是一种特异性表达于肿瘤脉管系统且物种间高度保守的Ⅰ型膜蛋白。后来的研究发现TEM8是炭疽毒素保护性抗原（PA）的受体，作为炭疽毒素的“帮凶”，介导其进入宿主细胞。关于TEM8生理功能方面的研究则相对滞后了很多，仅有一些研究发现TEM8在肿瘤细胞的迁移、粘附和肿瘤血管生成等生理过程中发挥关键性作用，tem8基因敲除小鼠实验也证明TEM8对促进肿瘤血管生成和肿瘤生长起到重要作用，而对正常的生长发育和伤口愈合没有任何影响。TEM8这种特异性的分布以及在正常和肿瘤血管形成中功能的差异性，引起了极大关注。在最近的一篇临床前研究中发现，靶向TEM8胞外结构域的抗体能够抑制肿瘤血管的生成以及多种植入到小鼠体内的人肿瘤细胞的生长和迁移，这种抗TEM8抗体能够增强其他抗血管生成剂、血管靶向剂以及传统化疗药物的活性，并且没有发现其存在细胞毒性。本课题组在前期工作中开发了一种抗体样分子TEM8-Fc （TEM8N端与炭疽毒素保护性抗原PA结合的vWA结构域和IgG1Fc段组成的融合蛋白），发现它是一种具有抗血管生成能力的分子，能抑制多种肿瘤细胞的生长、迁移以及肿瘤血管的生成，然而其抑制肿瘤的机制尚未阐述清楚。为了弄清TEM8-Fc的抑瘤机制，首先需要弄清TEM8的生理性配体及其发挥生理功能的作用机制。本研究将研究焦点首先集中在关于TEM8生理性配体的研究上，因为只有找到它的生理性配体才能进一步阐明它在细胞生理条件下的功能作用，为靶向TEM8的肿瘤抗血管生成疗法提供理论依据。在找到TEM8的生理性配体后，又进一步研究了TEM8-Fc抗肿瘤血管生成的机制以及TEM8发挥生物学功能的机制。在研究中我们得出了如下结论：1.通过软琼脂克隆形成实验发现，TEM8和CMG2（特别是TEM8）能够使HEK293细胞的软琼脂克隆形成能力增加，即过表达TEM8或CMG2使HEK293细胞具有了恶性转化的特征。通过CCK8细胞增殖实验和划痕实验等验证了TEM8和CMG2的部分生理功能：TEM8促进细胞迁移，而CMG2促进细胞增殖。2.利用本课题组前期构建的抗体样分子TEM8-Fc与人肝癌组织匀浆液进行免疫共沉淀和SDS-PAGE电泳，把共沉下的蛋白条带经生物质谱分析发现了TEM8的两个可能的相互作用蛋白——尿型纤溶酶原激活剂（uPA）与α-烯醇化酶（α-enolase）。因为uPA是胞外可溶性的信号分子，而α-enolase主要在胞内和胞膜上发挥功能，所以推测uPA即是TEM8的生理性配体，于是下一步工作主要围绕uPA与TEM8展开。为了进一步确定两者之间的相互作用，我们先后用ELISA、WesternBlot等方法进行了验证，并且通过表面等离子体共振（SPR）的方法测定了TEM8-Fc与uPA的结合常数。TEM8-Fc结合到高分子量单链uPA（HMW-scuPA），高分子量双链uPA（HMW-tcuPA）和低分子量uPA（LMW-uPA）的结合常数分别为16.6nM，29.7nM和31.1nM。另外还通过溶圈实验和S2444发色底物法发现与TEM8的结合不会影响uPA的酶活性。3.构建了uPA的几种截短突变体与EGFP的融合蛋白表达载体，同时构建了TEM8胞外区（N端）与RFP的融合蛋白表达载体，然后将各种uPA截短突变体与EGFP的融合蛋白表达载体和TEM8胞外区（N端）与RFP的融合蛋白表达载体分别共转染到HEK293细胞中。最后通过FRET的方法确定了uPA与TEM8之间的相互作用区域。FRET的结果显示uPA的Kringle区和酶活性区的C端与TEM8的N端有FRET效应，即介导uPA与TEM8相互作用区域是它的Kringle结构域和催化结构域的C-末端。因此uPA与TEM8相互作用区域不同于uPA受体（uPAR）（uPA的EGF样结构域负责与uPAR相互作用）。4.用IP的方法证明了uPA能够剂量依赖性的使TEM8磷酸化，而TEM8-Fc可拮抗uPA导致的TEM8磷酸化。通过Raybiotech公司的RTK磷酸化芯片和EGFR磷酸化位点芯片，发现uPA能够上调EGFR845位和1173位酪氨酸的磷酸化水平，而TEM8-Fc能拮抗它的作用。在细胞生物学方面研究了TEM8与uPA的相互作用对肿瘤生长和迁移的作用，通过迁移实验发现uPA能够显著地增加HepG2细胞的uPAR非依赖性的迁移，而TEM8-Fc能够封闭uPA的作用。最后观察到本组开发的两种抗体样分子TEM8-Fc和ATF-Fc具有协同抗肿瘤的作用。综上所述，本研究结果表明TEM8是uPA一种新型的受体，在调节肿瘤的生长和转移中起到了重要的作用。本组开发的抗体样分子TEM8-Fc正是通过封闭TEM8与uPA的相互作用来达到抗肿瘤血管生成的作用。

全文目录

缩略词表  6-7
摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-27
  1 炭疽毒素  14-15
  2 TEM8 和 CMG2 的蛋白结构  15-20
  3 TEM8 和 CMG2 的表达  20-21
  4 TEM8/CMG2 与细胞外基质蛋白的相互作用及它们的生理功能  21-24
  5 TEM8/CMG2 与胞内蛋白的相互作用  24-26
  6 靶向 TEM8 的肿瘤治疗  26-27
第一部分 TEM8 和 CMG2 生理功能研究  27-41
  1 材料  27-29
    1.1 质粒、感受态和细胞系  27
    1.2 主要试剂和耗材  27-28
    1.3 主要化学试剂配制  28
    1.4 主要仪器设备  28-29
  2 方法  29-32
    2.1 Myc-TEM8-EGFP 和 Myc-CMG2-EGFP 真核表达载体的构建  29-30
    2.2 目的基因载体转染 HEK293 细胞  30
    2.3 细胞的稳定筛选和单克隆化  30
    2.4 Western blot 检测融合蛋白 Myc-TEM8-EGFP 和 Myc-CMG2-EGFP 的表达水平  30-31
    2.5 CCK8 法检测转染 TEM8 或 CMG2 对细胞增殖的影响  31
    2.6 Woundhealing 实验（细胞划痕法）检测转染 TEM8 或 CMG2 对细胞体外迁移的影响  31
    2.7 软琼脂克隆形成实验检测转染 TEM8 或 CMG2 对细胞克隆形成的影响  31-32
  3 结果  32-40
    3.1 pcDNA3.1(+)/EGFP 真核表达载体的构建及鉴定  32-33
    3.2 目的基因（Myc-TEM8 和 Myc-CMG2）的获得（优化合成）  33-35
    3.3 pcDNA3.1(+)/Myc-TEM8-EGFP 和 pcDNA3.1(+)/Myc-CMG2-EGFP真核表达载体的构建及鉴定  35-36
    3.4 Western blot 检测融合蛋白 Myc-TEM8-EGFP 和 Myc-CMG2-EGFP 的表达水平  36-37
    3.5 TEM8 或 CMG2 的过表达对 HEK293 细胞生长的影响  37
    3.6 TEM8 或 CMG2 的过表达对 HEK293 细胞体外迁移能力的影响  37-38
    3.7 过表达 TEM8 或 CMG2 对 HEK293 细胞转化能力的影响  38-40
  4 小结  40-41
第二部分 TEM8 相互作用蛋白的研究  41-61
  1 材料  41-42
    1.1 细胞系  41
    1.2 主要试剂和耗材  41-42
    1.3 主要化学试剂配制  42
    1.4 主要仪器设备  42
  2 方法  42-48
    2.1 TEM8-Fc 相互作用蛋白的亲和纯化  42-44
    2.2 质谱分析及鉴定  44
    2.3 免疫沉淀（Fc pull-down）和免疫印记验证 TEM8-Fc 与重组 uPA 的相互作用  44-45
    2.4 ELISA 检测 TEM8-Fc 与重组 uPA 的结合能力  45-46
    2.5 表面等离子体共振（SPR）方法测定 TEM8-Fc 与 uPA 的结合常数  46
    2.6 溶圈法检测 TEM8-Fc 与 uPA 的结合对 uPA 活性的影响  46-47
    2.7 发色底物 S-2444 法检测 uPA 结合到细胞表面后的活性  47-48
  3 结果  48-60
    3.1 确定 TEM8 的相互作用蛋白  48-50
    3.2 免疫沉淀方法验证 uPA 和 alpha enolase 与 TEM8 的相互作用  50-54
    3.3 ELISA 方法验证 uPA 与 TEM8 的相互作用  54
    3.4 SPR 方法测定 TEM8-Fc 与几种重组 uPA 之间相互作用的反应动力学常数  54-57
    3.5 TEM8 与 uPA 的结合对 uPA 酶活性的影响  57
    3.6 uPA 与细胞表面 TEM8 的结合  57-60
  4 小结  60-61
第三部分 uPA 与 TEM8 的相互作用区域研究  61-74
  1 材料  61-62
    1.1 细胞系  61
    1.2 主要试剂和耗材  61
    1.3 主要化学试剂配制  61
    1.4 主要仪器设备  61-62
  2 方法  62-66
    2.1 FRET 载体的构建  62-65
    2.2 稳定细胞株的构建  65
    2.3 共聚焦显微镜 FRET 成像  65-66
    2.4 其他方法  66
  3 结果  66-73
    3.1 真核表达载体 pcDNA3.1(+)(hygro)/TEM8-N-RFP 的构建及其鉴定  66-67
    3.2 TEM8-N-RFP 融合蛋白的表达  67-68
    3.3 uPA 截短型突变体与 EGFP 重组真核表达载体的构建及其鉴定  68-69
    3.4 uPA 截短突变体与 EGFP 的融合蛋白的表达  69-70
    3.5 共聚焦显微镜 FRET 成像  70-73
  4 小结  73-74
第四部分 TEM8 与 uPA 相互作用的生物学意义研究  74-89
  1 材料  75-76
    1.1 细胞系  75
    1.2 实验动物  75
    1.3 主要试剂和耗材  75-76
    1.4 主要化学试剂配制  76
    1.5 主要仪器设备  76
  2 方法  76-80
    2.1 流式细胞仪检测分析  76-77
    2.2 TEM8 磷酸化分析  77
    2.3 人 RTK 和 EGFR 磷酸化抗体芯片筛选  77-78
    2.4 细胞免疫荧光检测 TEM8 和 EGFR 的细胞定位  78-79
    2.5 软琼脂克隆形成实验检测 LMW-uPA 对细胞集落形成能力的影响  79
    2.6 侵袭实验检测 TEM8 在 uPA 诱导的细胞侵袭中的作用  79-80
    2.7 肿瘤生长实验检测 TEM8-Fc 和 ATF-Fc 联合抗肿瘤效果  80
  3 结果  80-87
    3.1 uPA 与 TEM8 的结合诱导 TEM8 发生磷酸化  80-81
    3.2 uPA 与 TEM8 的结合诱导 EGFR 发生磷酸化  81-85
    3.3 TEM8/uPA 相互作用对肿瘤生长和迁移起到重要作用  85-87
    3.4 TEM8-Fc 和 ATF-Fc 具有协同抗肿瘤活性  87
  4 小结  87-89
讨论  89-99
  1 TEM8 与 CMG2 的比较  89-90
  2 实验方法的探讨  90-93
  3 实验结果讨论  93-97
  4 下一步课题的研究展望  97-99
结论  99-101
参考文献  101-115
文献综述：炭疽毒素受体结构和功能研究进展  115-129
  参考文献  124-129
个人简历  129-130
发表文章  130-131
致谢  131

TEM8与uPA的相互作用及其生物学意义研究

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