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微囊化分泌hTNF-a的基因工程细胞的构建及其抗肿瘤生长的研究

作　者: 高宇红
导　师: 彭瑞云; 薛毅珑
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 基因工程细胞 hTNF-α/293 APA微囊 肿瘤
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:恶性肿瘤已经成为当今世界一种严重威胁人们生命和健康的常见病、多发病。近年的研究已证明,一些细胞因子具有明确的抗肿瘤作用,如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α),TNF-α能够选择性杀伤癌细胞,而对正常细胞损伤小,这是它在临床应用上的优势。但由于TNF-α细胞因子在体内的生物半衰期甚短,如果全身给予大剂量的细胞因子,不仅肿瘤组织内的浓度很低,抗肿瘤效果也较差,而且常产生严重的毒副反应。本研究旨在应用基因转移技术,将表达肿瘤坏死因子α的载体细胞与肿瘤细胞共培养,使肿瘤坏死因子α在肿瘤局部高浓度表达,既可增加肿瘤坏死因子α直接杀伤肿瘤细胞的能力,又能减少对其他组织的毒副作用。在微囊化基因工程细胞制备平台的基础上,采用本组前期建立的制备方法,用APA微囊包裹hTNF-α/293细胞。然后,在体外培养下,观察APA微囊化TNF/293细胞特性及其对肿瘤增殖的抑制实验;一方面发挥囊内细胞持续分泌肿瘤坏死因子α的微型生物泵效应,在肿瘤组织中维持高浓度的细胞因子,产生持续杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长的作用;另一方面,发挥APA微囊的防止免疫排斥反应发生,并限制囊内高增殖活性细胞的过度生长的效应,为进一步利用该基因进行微囊化细胞移植治疗奠定基础。方法:(1)本研究首先采用基因克隆技术,构建分泌型人肿瘤坏死因子α(hTNF-α)的真核表达载体PSNAV2.0-TNF-α质粒;包装出高效表达RAAV2-TNF-α腺相关病毒,采用Lipofectin2000阳离子脂质体法,用测序鉴定正确PSNAV2.0-hTNF-α载体,将其转染人胚胎肾(human embryo kidney cells,Hek-293)细胞,对瞬时表达的转染细胞培养上清中分泌的TNF-α蛋白进行鉴定;采用G418抗性筛选法,建立可稳定分泌人肿瘤坏死因子α的hTNF-α/293细胞;采用RT-PCR、Western blot、ELISA和流式细胞仪等技术,检测人肿瘤坏死因子表达和分泌;(2)在体外培养下,TNF-α/293细胞的观察及其对肿瘤细胞抑制作用;在体外培养中0/293细胞组、Hek293细胞组、TNF-α/293细胞组培养液经过浓缩处理后,加入LOVO细胞和HepG2细胞培养板中,于不同的时间点用MTT法检测490nm下的光密度值;(3)在体外培养中,经比较5组APA微囊化TNF-α/293高剂量组、APA微囊化TNF-α/293中剂量组、APA微囊化TNF-α/293低剂量组、阴性组APA微囊化0/293细胞组,阳性药加入TNF-α因子(200ng/ml),加入LOVO细胞和HepG2细胞培养板中,于不同的时间点用MTT法检测490nm下的光密度值。结果:(1)利用PCR扩增的方法从pcDNA-hTNF-α中扩增得到hTNF-α基因。将目的基因插入到载体PSNA2.0(7115bp)EcoRI和SalI酶两酶切位点之间,构建PSNAV2.0-hTNF-α质粒。所建立的单克隆hTNF-α/293细胞株,在48h后可持续分泌人肿瘤坏死因子α;(2)体外培养的Hek-293细胞组和0/293细胞组对LOVO细胞和HepG2细胞增殖无抑制作用,两组之间差异无显著性;TNF-α/293细胞组和TNF-α对照组24h、48h、72h吸光度值低于0/293细胞组和Hek-293细胞组,差异有显著性;表明TNF-α/293细胞组对LOVO细胞和HepG2细胞的增殖有显著的抑制作用;(3)体外培养的APA微囊化0/293细胞组对LOVO细胞和HepG2细胞增殖无抑制作用,P>0.05为差异无显著性意义;APA微囊化TNF-α/293细胞中、高剂量组和TNF-α阳性组在24h,48h,72h吸光度值低于APA微囊化0/293细胞组,P<0.05为差异有显著性意义,说明TNF-α/293细胞中、高剂量组和阳性对照组对LOVO细胞和HepG2细胞的增殖有显著的抑制作用。结论:于人胚胎肾细胞中成功构建了可持续分泌肿瘤坏死因子α的基因工程细胞,即hTNF-α/293细胞;本研究显示了APA微囊化的该细胞与肝癌和结肠癌等肿瘤细胞共培养时,可产生抑制肿瘤细胞增殖的活性,并且呈现剂量依赖性; hTNF-α/293细胞产生的蛋白可以自由扩散出APA微囊膜外发挥抗肿瘤活性,APA微囊化hTNF-α/293细胞可望成为辅助治疗肿瘤的新技术,值得进一步研究。

全文目录


缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
主要仪器  11-12
前言  12-16
  参考文献  13-16
第一部分 构建分泌人肿瘤坏死因子基因工程细胞  16-36
  第一节 PSNA2.0-hTNF-α 重组腺相关病毒质粒的构建  16-26
    材料与方法  16-23
    结果  23-26
  第二节 RAAV2-hTNF-α 重组腺病毒的获得  26-29
    材料与方法  26-28
    结果  28-29
  第三节 稳定分泌 hTNF-α 的 hTNF-α/293 细胞的构建  29-33
    材料与方法  29-32
    结果  32-33
  讨论  33-35
  结论  35
  参考文献  35-36
第二部分 体外培养下 TNF/293 细胞的观察及对肿瘤细胞抑制作用  36-44
  第一节 体外培养下 TNF/293 细胞的形态特征和生长特性  36-39
    材料与方法  36-37
    结果  37-39
  第二节 体外培养下 TNF/293 细胞对人肿瘤细胞增殖的抑制作用  39-41
    材料与方法  39
    结果  39-41
  讨论  41-42
  结论  42
  参考文献  42-44
第三部分 体外培养下 APA 微囊化 TNF/293 细胞特性的观察及其对 肿瘤细胞增殖的抑制作用  44-55
  第一节 体外培养下APA微囊化TNF/293细胞的形态特征  44-47
    材料与方法  44-45
    结果  45-47
  第二节 体外培养下 APA 微囊化 TNF/293 细胞分泌目的蛋白的检测  47-48
    材料与方法  47
    结果  47-48
  第三节 体外培养下 APA 微囊化 TNF/293 细胞对人肿瘤细胞增殖的抑制作用  48-52
    材料与方法  48-50
    结果  50-52
  讨论  52-53
  结论  53
  参考文献  53-55
全文结论  55
本研究的创新点  55-56
简历  56-57
致谢  57-58
综述  58-63
  参考文献  61-63

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究
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