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NRG1/ErbB4表达调控在精神分裂症中的作用初探

作　者: 李树玲
导　师: 宫泽辉
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 精神分裂症 NRG1 ErbB4 动物模型
分类号: R749.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

精神分裂症（schizophrenia）是一类严重的致残性精神疾病，被称为“影响人类的最坏的疾病”，全球终身患病率约为1%。由于精神分裂症缺乏明显的病理学特征，迄今对其发病机制仍不清楚，目前普遍接受的观点是精神分裂症是在环境因素影响下，多个“中至微效”基因协同作用的结果，神经发育因素参与其中。遗传学研究发现了多个与精神分裂症相关的重要候选基因，其中神经调节素1（neuregulin1，NRG1）及其受体ErbB4的编码基因均被鉴定为精神分裂症的易感基因。精神分裂症患者中NRG1和ErbB4表达上调，信号转导增强。NRG1/ErbB4基因突变小鼠表现精神分裂症样症状。研究发现，NRG1/ErbB4信号转导调控神经发育和突触可塑性，影响多巴胺、谷氨酸和γ-氨基丁酸等多个神经递质系统。基因在不同脑区不同时间点的表达对神经系统的影响具有多样化的特点，对疾病的效应也有差异。本研究用慢病毒介导ErbB4特异性miRNA干扰时空特异性抑制动物脑内ErbB4基因表达，观察其行为学变化并在不同的精神分裂症动物模型上检测NRG1和ErbB4表达改变，以此探讨NRG1/ErbB4表达调控在精神分裂症发生发展中的作用。获得的具体结果如下：1.构建了以ErbB4为靶向基因的miRNA质粒。为实现ErbB4基因表达的特异性调控，设计合成ErbB4基因特异性miRNA前体寡核苷酸，构建重组miRNA干扰质粒。从大鼠脑分离提取总RNA，经RT-PCR构建靶序列表达质粒，并将其与miRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞后，经实时定量RT-PCR技术鉴定显示，构建的miRNA质粒具有理想的干扰效果，抑制率超过了70%。2.构建了ErbB4基因miRNA慢病毒表达质粒并包装收获了高滴度慢病毒。为实现干扰序列在活体神经元中的长期稳定表达，将ErbB4特异性miRNA干扰序列装载入慢病毒表达质粒，和慢病毒包装系统共转染HEK293T细胞，收集浓缩培养上清，得慢病毒浓缩液。流式细胞术检测报告基因GFP的表达量，计算得病毒活性滴度为1.0×109转导单位（TU）/ml。3.在动物海马齿状回定位注射ErbB4特异性miRNA慢病毒，外源基因长期稳定表达，慢病毒主要感染神经元。成年小鼠海马齿状回定位注射慢病毒，6个月后仍观察到了与miRNA同顺反子表达的GFP的表达。说明慢病毒介导的ErbB4特异性miRNA能在活体脑组织长期稳定表达。脑冰冻切片免疫荧光染色显示，慢病毒转导的细胞多呈神经元核抗原（NeuN）标记阳性，并与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）标记不重叠，提示慢病毒转导的主要细胞类型为神经元。4． miRNA干扰成年小鼠海马齿状回ErbB4的表达，对其行为活动无明显影响。给成年Balb/c小鼠海马齿状回定位注射ErbB4特异性miRNA慢病毒，干扰ErbB4的表达后，观察其对小鼠行为学的影响。结果显示，与溶剂对照组小鼠比较，慢病毒介导ErbB4干扰组小鼠在自发活动水平、跳台被动回避潜伏期、MK-801诱导的活动亢进等方面均没有表现出明显差异。提示，用慢病毒介导miRNA干扰成年小鼠海马齿状回神经元ErbB4的表达，可能不足以影响小鼠的行为活动。分析原因可能是正常成年动物神经发育成熟基础上的NRG1/ErbB4功能异常对疾病的影响较小，并且是对单一脑区的单一基因表达调控的干扰，已不足以引起明显的行为学改变。5．在断乳后大鼠社会隔离模型上NRG1和ErbB4的表达无明显变化。取断乳的雄性SD大鼠随机分组。隔离饲养组动物单笼饲养，社会饲养组动物每笼4只饲养。6周后，社会隔离动物表现出体重增加，自发活动增强，社会交往行为改变，Morris水迷宫实验学习记忆行为有细微差异，但无明显统计学差异。用Western blot方法检测NRG1和ErbB4蛋白的表达量，社会隔离组大鼠与对照大鼠比较，NRG1和ErbB4蛋白表达量没有明显改变。提示断乳后的社会隔离处理不足以引起Nrg1和ErbB4蛋白表达调控的改变。6.慢性氯胺酮处理大鼠海马脑区NRG1和ErbB4蛋白表达明显增加。NMDA受体非竞争性拮抗剂苯环己哌啶（PCP)、氯胺酮和MK-801等药物可以加重精神分裂症患者的症状或者诱导正常个体产生精神分裂样症状，被用作诱导动物精神分裂症样症状的工具药。SD大鼠腹腔注射氯胺酮15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg或生理盐水溶剂对照，每日2次，连续7天。末次给药24h后取脑，用Western-blot检测到氯胺酮三个剂量组大鼠海马脑区的NRG1及ErbB4蛋白含量与盐水组相比较均有明显的升高。提示NMDA受体拮抗剂诱导NRG1/ErbB4蛋白表达的上调，这可能是精神分裂症病理机制之一。7．大鼠新生期用氯胺酮处理，明显影响成年后的认知功能。取新生6天龄SD大鼠，分别皮下注射氯胺酮15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg或生理盐水溶剂对照，重复处理16天，观察其行为学变化。给药期间发现动物体重随药物剂量增加而降低。在大鼠成年后自发活动无明显异常；在高架零迷宫实验中没有表现出明显的焦虑行为；在物体识别实验中，氯胺酮30mg/kg和60mg/kg处理组与生理盐水组相比，大鼠对新奇物体的识别能力显著性降低；在Morris水迷宫实验中，新生期氯胺酮处理组动物在训练阶段和空间探索阶段无异常，但工作记忆测试阶段成绩降低。表明新生期氯胺酮重复处理造成了大鼠成年后的认知缺陷。8．新生期氯胺酮处理和母爱剥夺对大鼠成年后的精神行为有明显影响，NRG1表达上调。SD大鼠随机分为对照组、母爱剥夺组、新生期氯胺酮30mg/kg处理组及新生期氯胺酮30mg/kg处理联合母爱剥夺组。从生后第6天至生后第21天每天皮下注射氯胺酮30mg/kg或生理盐水给药两次。母爱剥夺为生后第9天乳鼠与母鼠短暂的分笼饲养24h。动物成年后考察其行为变化。结果显示，大鼠成年后自发活动无明显异常；在高架零迷宫实验中没有表现出明显的焦虑行为。与生理盐水组相比，在物体识别实验中，新生期氯胺酮处理和母爱剥夺均使大鼠对新奇物体的识别能力显著性降低；两种处理也均使动物对精神刺激剂甲基苯丙胺所致的活动亢进的敏感性增高；合并处理的雄性大鼠前脉冲抑制（PPI）受损，表明两种处理的交互作用。Western-blot检测显示新生期氯胺酮重复处理和母爱剥夺使海马脑区NRG1表达上调，ErbB4蛋白含量无明显变化。以上结果提示新生期氯胺酮重复处理和母爱剥夺使动物成年后表现精神分裂症样特征，模型中NRG1/ErbB4信号通路的异常可能是精神分裂症病理机制之一。9. ErbB特异性酪氨酸激酶抑制剂能部分对抗MK-801诱发的小鼠高活动性。MK-8010.25mg/kg腹腔注射诱导小鼠的自发活动亢进；脑室注射ErbB特异性酪氨酸激酶抑制剂能部分对抗MK-801诱导的高活动性。提示，ErbB受体活性与精神分裂症部分症状密切相关，抑制ErbB受体活性可能具有改善精神分裂症部分症状的作用。本研究显示，慢病毒可介导基因在动物脑内的时空特异性表达，作用长期稳定，提示慢病毒可以作为时空特异性调控基因表达的工具，促进对基因在不同脑区、不同神经发育时间点对疾病效应的理解。不同的精神分裂症动物模型中NRG1和ErbB4发生差异性表达变化，提示不同的诱导因素在不同发育阶段可能通过调控不同的基因对神经系统产生不同的影响，而易感基因在不同发育阶段不同脑区的表达对疾病的效应不同，进一步提示神经发育在精神分裂症发生发展中的重要性。ErbB4的受体活性是否可以作为抗精神分裂症治疗的靶标值得深入探讨。

全文目录

缩略词表  5-7
摘要  7-11
ABSTRACT  11-15
前言  15-27
第一部分慢病毒介导成年动物齿状回ErbB4基因miRNA干扰的行为学研究  27-53
  前言  27-29
  材料和方法  29-43
  实验结果  43-50
  讨论  50-53
第二部分精神分裂症动物模型的建立与NRG1/ErbB4表达的相关性研究  53-85
  前言  53-54
  材料和方法  54-63
  实验结果  63-79
  讨论  79-85
总结  85-87
参考文献  87-97
文献综述  97-107
  参考文献  103-107
个人简历  107-108
致谢  108

NRG1/ErbB4表达调控在精神分裂症中的作用初探

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