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肌肉特异性敲除TβRⅡ对去神经性肌萎缩的影响及其机制的初步研究

作　者: 王旭
导　师: 范明; 陈晓萍
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理生理学
关键词: TβRII 骨骼肌去神经肌萎缩
分类号: R746.4
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肌肉的发育和分化是高度有序的过程,在某些生理或病理状态下,如坐骨神经离断、长期卧床、航天失重、恶性肿瘤、饥饿均会导致肌肉萎缩的发生。虽然几十年来研究者不断探询肌肉发育和肌萎缩的发生机理,但很多机制还不清楚,限制了肌肉萎缩的临床治疗。影响肌肉发育和分化的因素很多,其中转化生长因子家族成员是一类重要的调控因子。TβRII是转化生长因子TGFβ1,TGFβ2,TGFβ3发挥作用的重要环节,目前对于TGFβ-TβRII-SMAD3在肌肉发育和分化以及在肌肉萎缩中的作用并不十分清楚。本研究主要利用骨骼肌特异敲除TβRII的小鼠模型来研究TβRII敲除对肌肉发育及肌肉萎缩的影响。首先,我们利用floxp/Cre技术在世界上首次培育出了骨骼肌特异性敲除TβRII的小鼠模型。由于全身敲除TβRII会导致小鼠的早期死亡,我们引进了携带肌酸激酶启动子的MCK-Cre转基因小鼠和携带TβRIIflox/flox的转基因小鼠。我们首先将两种小鼠进行扩群,而后利用雄性TβRIIflox/flox纯合子转基因小鼠与雌性MCK-Cre转基因小鼠进行杂交,培育出TβRIIflox/wt ;MCK-Ce+的基因半敲除小鼠,并进行了基因型的鉴定。而后利用TβRIIflox/wt ;MCK-Cre+小鼠与TβRIIflox/flox小鼠进行杂交,后代中鉴定出约1/4比例TβRII敲除小鼠,基因型为TβRIIflox/flox ;MCK-Cre+。该小鼠外观形态及活动与对照鼠相比无明显差别。在用敲除小鼠继续与TβRIIflox/flox纯合子转基因小鼠进行杂交繁殖后代时表现出正常的生育能力且其后代亦发育正常。我们继而利用Real time PCR技术对TβRII在敲除小鼠不同类型肌肉中的表达水平进行了检测。结果显示在比目鱼肌、跖肌、腓肠肌这3种不同类型的肌肉组织中TβRII的表达均明显下调。我们对敲除小鼠和对照小鼠进行了大体指标的检测并进行了统计学分析比较。结果显示,基因敲除小鼠在体重,比目鱼肌、跖肌、腓肠肌与体重的比值方面与对照鼠相比均无统计学差异。肌肉组织依据其含有的纤维类型的不同分为快肌和慢肌,分别以跖肌和比目鱼肌为代表。单根肌纤维的横截面积是衡量肌肉组织萎缩与否的重要指标,因而我们完整分离了敲除鼠和对照鼠的比目鱼肌、跖肌,进行了组织切片HE染色,利用Image-Proplus6.0软件计算了单根肌纤维的横截面积,结果显示敲除鼠与对照鼠的单根肌纤维的横截面积无统计学差异。肌肉的发育和分化受到特异基因的精细调节,我们研究了TβRII敲除对分化的重要调控基因成肌分化因子MRFs mRNA的影响。结果显示:快肌（跖肌）4个成肌分化因子都发生了明显上调,其中Myogenin上调19.18倍, MyoD 4.18倍, MRF4 2.25倍,Myf5 2.8倍。提示TβRII敲除在mRNA水平上引起了某些基因的改变。为了研究TGFβ-TβRII信号通路对肌肉萎缩的影响,我们采用了小鼠坐骨神经离断14天模型进行研究。结果显示:坐骨神经离断14天后,神经损伤侧比目鱼肌、跖肌、腓肠肌的重量与假手术侧相比,其减轻程度与对照鼠相比无显著性差异（p>0.05）。肌肉组织切片进行HE染色,结果显示:敲除小鼠的比目鱼肌在去神经支配14天后,单根肌纤维的横截面积与假手术侧相比下降了36.17%,而对照鼠下降了10.64%,两者相比p<0.01;敲除小鼠的跖肌在去神经支配14天后,单根肌纤维的横截面积与假手术侧相比下降了38.29%而对照鼠下降了21.12%,两者相比p<0.05。提示TβRII的敲除促进了坐骨神经离断条件下的比目鱼肌和跖肌肌纤维的萎缩。我们进而对其可能的分子机制进行了初步研究。结果显示:去神经支配条件下,TβRII的敲除对成肌分化因子Myogenin,MyoD,MRF4,Myf5转录水平略有影响,但与上述正常神经支配时TβRII的敲除对成肌分化因子MRFs的影响对比,明显减弱,推测影响MRFs表达的TGFβ细胞因子的作用受到明显的神经因素影响。AKT-P70S6K信号通路是影响蛋白合成的重要途径;Atrogin-1和MuRF₁是近年来发现的肌肉特异性的泛素连接酶成分,其高表达可引起肌纤维的萎缩。我们分别研究了比目鱼肌中和跖肌在去神经支配条件下TβRII的敲除对蛋白合成和分解的影响。结果显示:比目鱼肌中TβRII的敲除明显抑制了P70S6K的磷酸化;而对于跖肌,TβRII的敲除明显上调了Atrogin-1的表达。在比目鱼肌和跖肌中,TβRII的敲除对Bax与Bcl2的比值均无明显影响。我们继续研究了在去神经支配状态下,TβRII的敲除对肌纤维类型转化的影响。结果显示:TβRII敲除动物去神经后,快肌和慢肌的代谢都有向有氧氧化的方向转变的趋势,同时慢肌中的IIa,IIx型肌纤维成分的表达下降,而快肌中的I型纤维成分的表达则上升到2.9倍。为了进一步验证实验中得到的研究线索,为今后更好的开展进一步的研究工作,我们利用生物信息学方法搜索了与我们实验中肌萎缩和肌纤维类型转化密切相关的关键调节蛋白的基因启动子区,预测了一些能直接与转录因子SMAD3结合的保守调控位点,并将这些基因的启动子区构建到了荧光素酶报告基因表达载体。为了进行TβRII敲除后进行回复实验,我们构建了TβRII的全长蛋白表达质粒和2个蛋白表达缺失突变体质粒。总之,我们先后共构建了与SMAD3信号通路相关的蛋白表达质粒和荧光素酶报告基因检测质粒共计15个。综上所述,我们在世界上首次成功的培育了骨骼肌特异性敲除TβRII的基因敲除小鼠,并利用敲除小鼠建立了去神经性肌萎缩模型,观察了TβRII的敲除对去神经性肌肉萎缩的影响。发现TβRII的敲除促进了失神经支配状态下的肌纤维的萎缩,同时可能影响了肌纤维的类型转化。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-17
第一部分骨骼肌特异性敲除 TβRII 小鼠模型的建立  17-31
  一、材料和方法  17-21
  二、实验结果  21-27
  三、讨论  27-31
第二部分 TβRII 受体敲除对去神经性肌肉萎缩的影响  31-37
  一、材料和方法  31-33
  二、实验结果  33-36
  三、讨论  36-37
第三部分 TβRII 受体敲除促进去神经肌纤维萎缩的分子机制研究  37-51
  一、材料和方法  37-41
  二、实验结果  41-46
  三、讨论  46-51
第四部分 TβRII 受体敲除对去神经肌纤维类型转化的影响  51-57
  一、材料和方法  51-53
  二、实验结果  53-55
  三、讨论  55-57
第五部分载体构建  57-71
  一、材料和方法  57-64
  二、实验结果  64-71
总结  71-73
参考文献  73-79
附录Ⅰ：构建载体测序图  79-91
附录Ⅱ：综述  91-99
  参考文献  95-99
附录Ⅲ：附发表论文  99-107
附录Ⅳ：发表论文情况  107-109
个人简历  109-111
致谢  111

肌肉特异性敲除TβRⅡ对去神经性肌萎缩的影响及其机制的初步研究

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