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人乳头瘤病毒16型（HPV16）药物筛选模型的建立及药效学评价

作　者: 陆巧妮
导　师: 李玉环; 韩燕星
学　校: 北京协和医学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 16型人乳头瘤病毒 Caski细胞 假病毒细胞感染模型 假病毒小鼠感染模型 化合物L90512-2 复方高效碘
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


宫颈癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤,其发病率位居女性肿瘤的第二位,是全球最主要的癌症之一。流行病学显示,持续性感染高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是宫颈癌最重要的致病因素。约95%宫颈癌活组织检查均检测出有HPV的感染,证实了人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌密切相关。大约有50%和20%的宫颈癌病例分别检测出高危型的HPV16和18,这两种基因型的HPV在宫颈癌中的感染率最高。因此,大多数研究主要是集中在HPV16和18的生物学研究上。在目前HPV治疗性疫苗没有取得突破性的进展,预防性疫苗仅适用于部分人群的情况下,治疗性药物的研究和开发仍然显得很重要。而在药物研发的最初阶段,关键在于能否建立稳定,快速,有效的药物筛选模型并加以应用。本课题主要研究的目的是建立抗HPV16药物的筛选模型,用于抗HPV16药物的发现。采用HPV16阳性细胞Caski,以HPV16E6,E7基因为靶点,(3-actin为内参基因,提取细胞的总RNA,反转录合成cDNA,再以cDNA为模板进行Real-time PCR,通过扩增曲线和溶解曲线,最终确定PCR反应条件和特异性E6, E7,β-actin引物,建立筛选抗HPV16候选物的Real-time PCR方法。以抗病毒药物西多福韦(CDV)作为Caski:细胞模型的阳性对照药物。CDV处理Caski细胞,48h后提取细胞内的总RNA,通过Real-time PCR检测E6,E7在基因水平上的变化。CDV对Caski细胞HPV16E6mRNA表达的抑制呈剂量依赖效应,125μg/ml和41.67μtg/ml的CDV对Caski细胞HPV16E6mRNA抑制率分别为54.10%和50.27%,对E7mRNA抑制率分别为47.97%和52.75%。通过Caski细胞模型对50余个化合物和化学复方制剂进行筛选,得到了具有抗HPV16活性的阳性化合物L90512-2。受试化合物L90512-2处理Caski细胞48h后,提取细胞内的总RNA,最后进行Real-time PCR。化合物L90512-2对Caski细胞HPV16E6mRNA表达的抑制呈剂量依赖效应,浓度为40μg/ml的L90512-2对Caski细胞HPV16E6和E7mRNA的表达有下调作用,抑制率分别为72.6%和77.06%。western-blotting的结果显示浓度为40μg/ml的L90512-2对Caski细胞HPV16E6蛋白表达有下调作用,抑制率达71%。并且浓度为40μg/ml,20μg/ml,10μg/ml,5μg/ml的L90512-2对Caski细胞HPV16E7蛋白的表达均有下调作用,抑制率分别为82%,81%,77%,66%。另外初步探讨了化合物L90512-2对肿瘤抑制因子p53和pRb蛋白的影响。40μg/ml的L90512-2能够提高Caski细胞内的p53和pRb蛋白的表达。化合物L90512-2仅仅是通过降低E6,E7蛋白水平从而间接提高细胞内的p53和pRb蛋白水平或者是还通过其他机制来提高p53和pRb蛋白的表达,还需进一步的深入研究。采用含HPV16病毒结构蛋白L1和L2基因的表达质粒和含GFP基因的报告质粒共转染293T17细胞的方法成功制备了HPV16假病毒,并且建立了HPV16假病毒的细胞感染模型。将HPV16假病毒细胞感染模型作为筛选模型,得到了具有抗HPV16活性的复方高效碘,荧光检测结果和western-blotting结果均显示复方高效碘在浓度为1/24原液时有较好的抑制病毒入胞的作用。初步建立了以GFP为报告基因的HPV16假病毒小鼠模型,并且采用该模型对复方高效碘的乳膏剂抗HPV16作用进行了初步研究,结果显示其具有抑制HPV16感染小鼠阴道上皮细胞的作用。但由于存在较大的背景荧光,今后还应对假病毒小鼠模型的试验条件进一步优化,提高其实用性。

全文目录


缩略语表  5-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-14
实验材料  14-19
实验方法  19-29
结果  29-47
讨论  47-52
小结  52-53
参考文献  53-55
综述  55-67
  参考文献  65-67
硕士学习期间发表的文章  67
参加的学术会议  67-68
致谢  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 子宫肿瘤
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