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烟碱对大鼠膝骨关节炎软骨的保护作用及其机制研究

作　者: 朱辰蕾
导　师: 范卫民; 胡军
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: 骨关节炎大鼠烟碱烟碱乙酰胆碱受体炎性反应
分类号: R687.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

骨性关节炎（osteoarthritis, OA）是一种严重影响老年人的身心健康和生活质量的最常见的慢性退行性关节病损，以缓慢发展的关节疼痛、僵硬、肥大伴活动受限等为主要特点，一直是医学界关注的重点研究方向。OA的发病率随年龄增加而升高，随着我国逐渐步入老龄化社会，预期发病率将呈逐年增高的趋势。OA以关节软骨细胞的变性为特征，但对其确切的病因机制目前仍不清楚。依据OA的发病部位、受累关节多少和发病特点，膝关节OA最常见，早期主要症状为膝关节疼痛、酸软，以上下楼梯等关节活动时明显。晚期可出现关节运动受限、肌萎缩、膝内外翻等畸形。目前，大部分对膝关节OA发病机制的研究，主要围绕关节软骨细胞及其细胞外基质（胶原和蛋白聚糖）变异与降解和炎性细胞因子的参与作用而展开，近十年来，炎性细胞因子在OA发生、发展中的作用成为最受关注的内容。通过对炎性细胞因子在OA发病中的作用机制和作用环节的调控，有望提出OA的生物学防治措施。20世纪80年代末，Felson的横断面流行病学研究和队列研究所证实吸烟与骨关节炎呈负相关，但具体机制不清楚。烟草中的主要成分—烟碱，俗称尼古丁，属于吡啶族生物碱，烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor,nAChR）的激动剂。最新的研究证据显示，烟碱激活nAChR通过胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway）发挥免疫炎性调节作用，被认为是机体最重要的免疫抗炎机制之一。大量研究表明胆碱能抗炎通路与脓毒症、类风湿性关节炎、阿尔兹海默病（AD）、癫痫、精神分裂症、肺癌、2型糖尿病（DM）、后天性重症肌无力（MG）、帕金森综合症（PD）、血管瘤及炎症、缺血再灌注损伤以及各种自身免疫性疾病的病理过程密切相关。胆碱能抗炎通路直接、迅速的作用于特定组织，抑制多种炎症介质的产生，是干预炎症的重要发展方向。本文工作第一部分首先应用大鼠膝关节炎模型系统研究nAChRs主要亚基α7及α4和β2在动物模型关节软骨中的表达改变规律，阐明nAChRs与OA发生、发展的相关性。第二部分继续以碘乙酸制备的OA大鼠模型为实验对象，观察烟碱对大鼠膝骨关节炎软骨的保护作用。第一部分大鼠膝骨关节炎模型的建立及烟碱受体在模型关节软骨中的表达改变目的：建立碘乙酸（monoiodoacetic acid, MIA）大鼠膝骨关节炎模型，并观察nAChRs主要亚基α7及α4和β2在动物模型关节软骨中的表达改变规律。方法：将20只SD大鼠随机分为2组，假手术组（Con组）10只，模型组（MIA组）10只。对MIA组大鼠右膝关节行MIA（1mg，50μl）膝关节腔内注射，假手术组大鼠右膝关节行生理盐水膝关节腔内注射作为空白对照，左膝作为自身对照，不予手术。每周造模一次，连续四次。各大鼠分别于术后第15天和第30天处死，每组每次处死5只。处死后大鼠提取右膝关节软骨组织标本，进行大体光镜和组织学病理切片观察关节软骨破坏情况，用反转录PCR（RT-PCR）法对各组大鼠右膝关节软骨内的Ⅱ型胶原、软骨蛋白聚糖（aggrecan）的表达进行检测，实时PCR（Real-time PCR）法观察nAChRs主要亚基α7及α4和β2在动物模型关节软骨中的表达改变规律。结果：各组大鼠手术后均恢复正常活动。1）MIA组大鼠手术后组织学变化明显，15天及30天的光镜评分和Mankin’s评分结果显著高于Con组。2）MIA组大鼠右膝关节软骨的α7、α4和β2的表达在第15天时变化不明显，在第30天时表达较空白对照组显著增高。3）MIA组大鼠右膝关节软骨Ⅱ型胶原和软骨蛋白聚糖较空白对照组组表达明显降低，且随着时间的推移降低趋势愈加明显。结论：膝关节腔注射MIA可明显破坏大鼠膝关节软骨，nAChRs主要亚基α7及α4和β2在大鼠膝关节软骨的表达改变，为研究胆碱能信号通路与OA病理机制的相关性打下了实验基础。第二部分烟碱对大鼠膝骨关节炎软骨的保护作用目的：研究烟碱干预对大鼠膝骨关节炎软骨的保护作用。方法：将40只SD大鼠随机分为4组，其中假手术组（Con组）10只，手术组（MIA组）10只，烟碱干预组（MIA+Nic0.25mg kg-1，N1组；MIA+Nic0.5mg kg-1，N2组）各10只。N1组和N2组在手术前一周持续分别腹腔注射烟碱（0.25或0.5mg kg-1）预处理，每日一次，Con组和MIA组手术前一周持续注射生理盐水。预处理结束后，MIA组、N1组和N2组的大鼠右膝关节行MIA（1mg，50μL）膝关节腔内注射，Con组大鼠右膝关节行生理盐水膝关节腔内注射。每周造模一次，一共造模4次。N1组和N2组大鼠在造模前、造模中、造模后均每日每只腹腔注射烟碱0.25或0.5mg kg-1。各组大鼠分别于术后第15天和第30天处死，每组每次处死5只。处死后大鼠提取右膝关节软骨组织标本，进行大体光镜和组织学病理切片观察关节软骨破坏情况，并用RT-PCR法对各组大鼠右膝关节软骨内的Ⅱ型胶原、软骨蛋白聚糖的表达进行检测。结果：各组大鼠手术后均恢复正常活动。1） MIA组大体光镜评分和Mankin’s评分显著高于Con组，N1组和N2组的大体光镜评分和Mankin’s评分明显低于MIA组，但未恢复至空白组水平。2）各组大鼠右膝关节软骨Ⅱ型胶原和软骨蛋白聚糖的RT-PCR结果显示，MIA组Ⅱ型胶原和软骨蛋白聚糖表达较Con组显著降低，N1组和N2组较MIA组Ⅱ型胶原和软骨蛋白聚糖表达明显增高，且有剂量依赖性。结论：烟碱对大鼠膝骨关节炎软骨具有保护作用。综上所述，本文工作的主要创新之处在于：建立膝关节腔内注射MIA大鼠OA模型，揭示了烟碱对MIA制备的OA模型鼠膝关节软骨具有显著的保护作用，其机制与nAChRs有关，为OA的治疗提供了新的思路，为研发靶向于nAChRs的抗炎保护剂提供了新的理论依据。

全文目录

英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-11
Abstract  11-17
前言  17-26
  参考文献  23-26
第一部分大鼠膝骨关节炎模型的建立及烟碱受体在模型关节软骨中的表达改变  26-48
  引言  26-27
  材料与方法  27-34
  结果  34-43
  讨论  43-46
  参考文献  46-48
第二部分烟碱对大鼠膝骨关节炎软骨的保护作用  48-70
  引言  48-49
  材料与方法  49-54
  结果  54-65
  讨论  65-68
  参考文献  68-70
文献综述  70-89
  参考文献  83-89
附录  89-90
致谢  90

烟碱对大鼠膝骨关节炎软骨的保护作用及其机制研究

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