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Gankyrin对乳腺癌转移的影响及其相关机制研究

作　者: 甄诚
导　师: 张学敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: Gankyrin 乳腺癌肿瘤转移迁移黏附
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤,每年全世界约有120万妇女患乳腺癌,占女性所有肿瘤发病数的18%。同时乳腺癌也是最易发生转移的恶性肿瘤之一,乳腺癌的转移已经成为乳腺癌患者致死的主要原因。因此研究乳腺癌转移的相关机制,发现新的调控分子和信号转导途径,对于药物研发,进而提高患者生存率和改善患者生活质量具有重要意义。gankyrin是近年来发现的一种癌基因。最初认为其表达产物Gankyrin蛋白质参与了26S蛋白酶体中19S亚基的调控。然而后续的研究发现Gankyrin与肿瘤的发生有密切关系。Gankyrin首先被报道在肝癌组织和多种肝癌细胞中高表达,并且能够使NIH3T3细胞发生转化。随后免疫组织化学分析发现其在食管鳞状上皮细胞癌、结肠癌和胰腺癌中表达升高。Gankyrin与肿瘤,特别是与消化道肿瘤发生的关系引起了广泛的关注。与此同时,Gankyrin促进肿瘤发生的分子机制也不断被发掘。国内外多个研究团队的研究结果表明,Gankyrin能够通过泛素-蛋白酶体通路促进Rb和P53的降解。另有报道指出Gankyrin能够拮抗p16INK4A的抑癌功能。本实验室发现Gankyrin在Ras诱导NIH3T3细胞转化的过程中表达水平明显上调,并介导了肺癌的肿瘤发生。进一步的研究发现Gankyrin通过RhoA-ROCK信号通路的调节最终导致抑癌基因PTEN的抑制和PI3K-AKt通路的持续激活。目前,国内外对Gankyrin的研究主要集中在消化系统肿瘤,Gankyrin在人体其他组织和器官中的表达水平、分子功能以及Gankyrin与其他肿瘤(如乳腺癌等)的关系仍鲜有报道。因此深入研究Gankyrin对乳腺癌转移的影响及其作用机制,将为肿瘤转移提供新的思路和潜在的治疗靶点。本研究首先对86例乳腺癌患者临床标本进行免疫组化分析,结果表明Gankyrin在癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常乳腺组织(P<0.001)。重要的是,在乳腺癌的淋巴结转移组和非转移组的比较中,我们发现Gankyrin在转移组的表达水平显著高于非转移组(P<0.001),这表明Gankyrin的表达水平与乳腺癌转移之间存在明显的相关性。我们通过进一步的研究分析了Gankyrin对细胞迁移、侵袭、黏附等一系列转移相关表型影响。结果表明Gankyrin能够促进乳腺癌细胞的迁移及对胞外基质的侵袭,并且Gankyrin能够抑制乳腺癌细胞对生长基质的黏附。同时我们还发现Gankyrin对细胞内骨架蛋白F-actin的聚合具有明显的调节作用。为进一步探索Gankyrin影响乳腺癌转移的分子机制,我们检测了Gankyrin对细胞内Rho家族小G蛋白的活性的影响。研究发现Gankyrin能够促进细胞内重要小G蛋白质Rac1和Cdc42的激活,同时下调RhoA-GTP的水平。综上所述,本研究首先发现了Gankyrin表达水平与临床乳腺癌转移的关系,随后分析了Gankyrin对乳腺癌细胞迁移、侵袭、黏附及F-actin聚合等肿瘤转移相关表型的影响,发现Gankyrin可能通过上述多个环节促进乳腺癌转移。上述研究发现了Gankyrin新的分子功能,为全面揭示Gankyrin影响乳腺癌转移的分子机制提供了基础和线索。

全文目录

英文缩略词  6-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
引言  12-14
第一部分材料与方法  14-25
  1 实验材料及来源  14-16
    1.1 菌株和质粒  14
    1.2 主要试剂及来源  14-15
    1.3 主要仪器设备  15
    1.4 实验所用溶液配方  15-16
    1.5 细胞培养  16
    1.6 组织样本来源  16
  2 主要实验及其步骤  16-25
    2.1 GST-PBD 质粒的构建  16-17
    2.2 GST 融合蛋白诱导表达与纯化  17-18
    2.3 GST 沉淀实验（GST pull-down）  18
    2.4 免疫共沉淀实验（Co-IP）  18-19
    2.5 逆转录病毒感染及细胞克隆筛选  19
    2.6 免疫组织化学实验  19-20
    2.7 细胞Transwell 迁移实验  20-21
    2.8 划痕实验  21
    2.9 细胞侵袭实验  21
    2.10 细胞免疫荧光实验  21-22
    2.11 F-actin 鬼笔环肽染色实验  22
    2.12 细胞黏附实验  22-23
    2.13 Rac1/Cdc42 活性检测实验（GST-PBD pull down）  23
    2.14 RhoA 活性检测实验（GST-RBD pull down）  23-24
    2.15 免疫组化结果的判读及统计分析  24-25
第二部分实验结果  25-43
  1 Gankyrin 表达水平与乳腺癌转移程度成正相关  25-29
    1.1 Gankyrin 在乳腺癌中高表达  25-27
    1.2 Gankyin 表达水平与乳腺癌淋巴结转移正相关  27-28
    1.3 本节小结  28-29
  2 Gankyrin 影响细胞的迁移、侵润和黏附  29-36
    2.1 MDA-MB-231 pBabe-Gankyrin 过表达细胞系的构建  29
    2.2 Gankyrin 对乳腺癌细胞运动迁移的影响  29-30
    2.3 Gankyrin 对乳腺癌细胞侵袭的影响  30-31
    2.4 Gankyrin 抑制细胞黏附  31-34
    2.5 Gankyrin 对细胞内F-actin 分布的影响  34
    2.6 本节小结  34-36
  3 Gankyrin 对细胞内Rho 家族小G 蛋白活性的影响  36-43
    3.1 GST-PBD 质粒的构建与融合蛋白的诱导纯化  36-37
    3.2 Gankyrin 对Rac1/Cdc42 活性的影响  37-38
    3.3 Gankyrin 抑制RhoA 的活性  38-39
    3.4 Gankyrin 对Rho 家族小G 蛋白活性的影响机制探讨  39-41
    3.5 本节小结  41-43
讨论  43-45
结论  45-46
参考文献  46-52
综述  52-64
  参考文献  58-64
个人简历  64-65
致谢  65

Gankyrin对乳腺癌转移的影响及其相关机制研究

内容摘要

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