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NK细胞对乳腺癌干细胞的免疫编辑作用及机制研究

作　者: 王玲燕
导　师: 宫锋
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 乳腺癌干细胞免疫编辑 NK细胞 NKG2D 流式细胞术
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,近年来,虽然肿瘤的诊断和治疗技术快速发展,但是乳腺癌患者的死亡率仍然居高不下,高转移性乳腺癌在当前依然是不治之症。肿瘤干细胞理论的提出使人们对肿瘤的认识揭开了新的篇章。肿瘤干细胞理论认为,肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新、无限增值及多向分化潜能的细胞,这部分细胞虽然只占少部分,但是在肿瘤的发生、演进、复发、耐药以及逃逸免疫系统的识别和清除过程中可能发挥了至关重要的作用。因此研究乳腺癌干细胞的生物学特性,将有助于我们深入演进这些肿瘤干细胞恶性生物学行为的产生机制,探讨乳腺癌的发病机理,并探寻新的更为有效的治疗方法。在肿瘤的发生发展过程中,免疫系统与肿瘤的关系极为复杂。随着研究的不断深入,人们认识到机体免疫系统和肿瘤细胞之间存在着相互作用:免疫系统重塑肿瘤细胞的免疫原性,肿瘤细胞则影响着免疫系统功能。这一过程称为免疫编辑。免疫编辑分为三个过程（3Es）:免疫清除（elimination）、免疫均衡（equilibrium）和免疫逃逸（escape）。它反映了免疫系统具有抵抗肿瘤的保护性功能,同时又对肿瘤具有塑型功能（tumor-sculpting functions）即对肿瘤细胞实施免疫选择压力,使弱免疫原性的肿瘤细胞得以逃逸并进一步生长。自然杀伤（NK）细胞是机体天然免疫的主要免疫细胞,是机体抗肿瘤的第一道防线。NK细胞能直接杀伤肿瘤细胞,在机体早期抗肿瘤和免疫监视中具有重要作用。NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性主要取决于细胞表面活化性受体和抑制性受体识别相应的配体后产生信号强度的综合。最新研究结果表明,NK细胞与肿瘤细胞之间不仅仅有杀伤作用,NK细胞与肿瘤细胞之间存在着免疫编辑,使双方的配-受体分子和生物学行为发生了改变。本课题拟以乳腺癌干细胞和NK细胞培养上清混合培养为反应体系,就以下两个方面进行深入研究和探讨:（1）NK细胞能否杀伤乳腺癌干细胞;（2）乳腺癌干细胞与NK细胞两者之间是否存在免疫编辑作用,以及两者的生物学行为的变化和相关的分子基础。本研究旨在揭示NK细胞和乳腺癌干细胞相互反应的关系,探索肿瘤细胞逃逸NK细胞免疫监视的新机理,寻找肿瘤治疗的新靶标。本课题的研究内容和结果主要包括以下几个方面:1.人乳腺癌细胞系MCF-7中乳腺癌干细胞（BCSCs）的分离培养和鉴定利用流式分选的方法从人MCF-7细胞中分离获得乳腺癌干细胞,这部分细胞可以在干细胞培养基中成球生长,所形成的干细胞球高表达Oct-4和Sox-2,在含血清培养基中经体外诱导分化后,可分化为表达CK-18和α-SMA的细胞。此外,CD44⁺CD24^-细胞能在体内连续成瘤。从MCF-7细胞中分离得到的non- CD44⁺CD24^-细胞在裸鼠体内也能成瘤,但是成瘤率远远低于CD44⁺CD24^-细胞,且成瘤需要的细胞数量多,周期长。2.人原代NK细胞的分离培养采用流式分选的方法从PBMC中分离培养NK细胞,流式细胞术检测结果显示分选后NK细胞（CD3^-CD56⁺）的纯度为90%以上,可以满足对NK细胞杀伤实验的要求。3.NK细胞对乳腺癌干细胞的杀伤活性检测收集培养2d的NK细胞的细胞培养上清,将此培养上清与CD44⁺CD24^-细胞亚群和non-CD44⁺CD24^-细胞亚群共培养,2d后收集细胞。在效靶比（E:T）分别为5:1和20:1的条件下,用⁵¹Cr释放实验检测NK对肿瘤细胞的杀伤效率,用K562细胞作为阳性细胞对照。结果显示:NK细胞对处理后的肿瘤细胞的杀伤效率远远低于对未处理细胞的杀伤效率。说明乳腺癌细胞对NK细胞的编辑作用影响了NK细胞的杀伤活性。4.免疫编辑后的乳腺癌干细胞对NK细胞的激活能力检测我们用分选得到的NK细胞处理乳腺癌干细胞,处理后的乳腺癌干细胞与NK细胞共培养24h,用ELISA检测NK细胞γ-IFN分泌水平,用流式细胞术检测NK细胞CD107a水平表达。结果发现NK细胞培养上清处理导致肿瘤细胞激活NK细胞分泌γ-IFN和表达CD107a的能力降低。5.免疫编辑后的乳腺癌干细胞表面NK细胞激活性/抑制性配体的检测乳腺癌干细胞与NK细胞培养上清共培养24h、48h后,流式细胞术检测乳腺癌干细胞表面相关分子的表达,结果显示,NK细胞培养基处理导致乳腺癌细胞表面表达NK细胞的NKG2D配体MIC A和MIC B表达均下调,而ULBPs和CIR配体HLA-I类分子表达无差异。6.MMPi在NK细胞和乳腺癌干细胞免疫编辑过程中的作用我们在编辑过程中加入MMPi,发现能部分的抑制编辑导致的乳腺癌干细胞表面MICA/B低表达,继续使用MMPi处理BCSCs和MCF-7细胞,流式细胞术检测发现MMPi处理显著上调其MICA/B的表达水平,这说明肿瘤细胞自分泌的MMP也能抑制其自身MICA/B表达。在这一基础上,我们又进一步检测了MMPi对NK杀伤乳腺癌干细胞的影响。MMPi处理NK细胞,能部分缓解NK细胞培养上清处理导致的NK细胞对乳腺癌干细胞杀伤效率的降低;以MMPi直接处理乳腺癌干细胞,显著增加NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤敏感性。这两点综合说明NK源性和肿瘤细胞源性MMP都参与降低MICA/B膜表达水平,规避NK细胞毒性效应。以上结果初步证明,乳腺癌干细胞和NK细胞存在相互编辑效应,相互编辑作用可能是建立在NKG2DL-NKG2D信号系统交互反应的基础上的。我们的研究初步揭示了乳腺癌干细胞与NK细胞的免疫编辑的效应和分子机制,其他肿瘤细胞与NK细胞的免疫编辑是否遵循同样的分子机制尚需进一步研究。

全文目录

英文缩略词  6-8
中文摘要  8-11
Abstract  11-14
前言  14-17
第一部分人乳腺癌细胞系MCF-7 中乳腺癌干细胞（BCSCs）的分离培养和鉴定  17-28
  实验材料  17-20
    一、主要实验试剂  17-18
    二、主要仪器设备  18
    三、主要试剂的配制  18-20
  试验方法  20-23
    一、乳腺癌细胞系的培养  20-21
    二、BCSCs的分离培养  21
    三、BCSCs的鉴定  21-22
    四、NOD/SCID小鼠的分组与肿瘤细胞的接种  22-23
  实验结果  23-26
    一、乳腺癌干细胞的分选结果  23
    二、CD44~+CD24~- 和non-CD44~+CD24~- 细胞亚群的生长特性  23-24
    三、CD44~+CD24~- 和non-CD44~+CD24~- 细胞亚群的干性和分化标记物检测  24-25
    四、CD44~+CD24~- 细胞的多向分化潜能  25-26
    五、CD44~+CD24~- 和non-CD44~+CD24~- 细胞亚群的体内成瘤能力  26
  小结  26-28
第二部分 NK细胞对乳腺癌干细胞的免疫编辑及机制初探  28-44
  实验材料  28-30
    一、主要实验试剂  28
    二、主要仪器设备  28-29
    三、主要试剂的配制  29-30
  试验方法  30-35
    一、PBMC分离培养  30
    二、原代NK（pNK）细胞分选培养和检测  30
    三、NK92 细胞的培养  30-31
    四、杀伤实验分组和时相点设置  31-32
    五、流式检测实验分组和时相点设置  32-33
    六、NK细胞杀伤活性测定：采用~(51)Cr释放法  33
    七、ELISA  33-34
    八、流式检测细胞表面的分子表达  34
    九、统计学处理  34-35
  实验结果  35-43
    一、原代NK细胞的分离培养  35
    二、NK细胞对CD44~+CD24~- 细胞和non-CD44~+CD24~- 细胞的杀伤活性  35-36
    三、NK细胞培养上清处理后的肿瘤细胞对NK细胞的激活能力检测  36-38
    四、流式检测结果  38-43
  小结  43-44
讨论  44-48
结论  48-49
参考文献  49-52
综述  52-62
  参考文献  58-62
个人简历  62-63
致谢  63

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