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雌激素受体检测新方法及在乳腺癌细胞PI3K通路研究中的应用

作　者: 朱莎
导　师: 殷咏梅
学　校: 南京医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 乳腺癌雌激素受体磷脂酰肌醇3激酶途径电化学技术生物传感器
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：新的证据表明雌激素受体（estrogen receptor，ER）和磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide3-kinase，PI3K）信号通路在乳腺癌的发展及治疗中起着关键作用。ER的表达水平及其与PI3K通路之间的联系对于乳腺癌内分泌治疗效果的预测及耐药潜在机制的研究有着极大的意义。我们基于电化学手段定量分析了雌激素受体，旨在进一步探讨雌激素受体阳性乳腺癌细胞的ER表达水平与PI3K通路之间的联系。方法：基于外切酶III (Exo III)保护的策略，我们构建了一种检测ER的电化学生物传感器。首先，我们设计两条互补的DNA双链(P1/P2)组成雌激素反应元件（estrogen-responsive element，EREs），其中P1链3’末端的巯基与金电极表面形成金巯键，将P1共价修饰在预先处理好的金电极上,而3’端修饰了亚甲基蓝（Methylene blue, MB）的P2则作为电化学信号探针。然后，P1与P2杂交形成带有信号分子的稳定DNA双链。ER与DNA双链的结合能有效阻止Exo III从3’巯基端逐步降解单核苷酸，这样MB标记的P2链可以被保留，从而保留可检测的电化学信号。体系中ER的量越多，被保留的P2链就越多，相应的电化学信号也越大，从而建立起ER与电化学信号之间的量化关系。同时,为了进一步探讨ER表达量与PI3K通路抑制剂之间的关系，我们用不同浓度的PI3K抑制剂BEZ-235作用于BT474乳腺癌细胞，随后检测了细胞核内ER表达水平的变化。结果：1.在本体系中， MB的信号随着反应溶液中ER的浓度增加而增加。信号大小与ER的浓度在0.5nM和100nM之间成线性关系，检测限为0.38nM。2.在MDA-MB-231（ER阴性）细胞核提取物中产生很微弱的信号，而在BT474（ER阳性），MCF-7（ER阳性）细胞核提取物中产生明显的信号。3.信号大小随着MCF-7细胞数增加而增大。4.用PI3K抑制剂BEZ-235处理BT474细胞6小时相对于DMSO处理过的的对照组产生明显增大的信号，且信号强度与抑制剂的量成正相关性。结论:1.我们构建了一种检测ER的新型电化学生物传感器。与先前报道的以金属纳米粒子为基础的比色分析法相比，此方法的灵敏度提高了65倍。2.此方法可直接用于细胞核提取物的检测，并可用来检测肿瘤细胞的ER表达水平。3.PI3K抑制剂可上调BT-474乳腺癌细胞核内ER的表达量，ER和PI3K通路有着密切的联系。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-11
材料与方法  11-17
  1 材料  11-13
    1.1 主要试剂  11-12
    1.2 试验细胞及培养原料：  12
    1.3 仪器设备：  12-13
  2 实验方法  13-17
    2.1 电化学生物传感器  13
    2.2 电化学系统  13-14
    2.3 电化学方法  14-16
    2.4 DNA 探针在金电极表面的固定  16
    2.5 细胞培养，细胞给药及核提取物的制备  16
    2.6 细胞提取物的制备  16-17
    2.7 电化学检测 ER  17
结果  17-23
  1. 传感器的原理  17-18
  2. 实验原理的可行性及特异性验证  18-19
  3. 定量检测 ER 纯品  19-21
  4. 不同乳腺癌细胞核内的 ER 检测  21
  5. MCF-7 乳腺癌细胞内 ER 的量化检测  21-22
  6. PI3K 通路抑制剂在乳腺癌细胞中对雌激素受体表达水平影响  22-23
讨论  23-26
结论  26-27
参考文献  27-34
综述  34-48
  参考文献  42-48
攻读学位期间发表论文情况  48-49
致谢  49

雌激素受体检测新方法及在乳腺癌细胞PI3K通路研究中的应用

内容摘要

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