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SCIRR10蛋白及其相关研究

作　者: 蔺宇
导　师: 刘少君
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: SCIRR10 TRH-R2 作用位点 COS-7细胞 PC12细胞 CPE
分类号: R651.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脊髓损伤修复相关10号基因（spinal cord injury and regeneration related gene No 10, SCIRR10）是我们实验室从大鼠脊髓原代神经元损伤消减杂交文库中筛选到的一个基因。前期研究发现SCIRR10基因分布于几乎整个中枢神经系统,多种技术证明了SCIRR10参与脊髓损伤与修复,发现损伤后脊髓内SCIRR10 mRNA和蛋白表达明显高调;通过酵母双杂交技术,发现了SCIRR10可以与促甲状腺素释放激素受体2（TRH-R2）和羧肽酶E（CPE）相互作用;通过多种实验证实了TRH-R2是SCIRR10蛋白的结合受体:信号转导研究发现SCIRR10蛋白可激活TRH-R2介导的MAPK-ERK和磷酸脂酶C两个信号转导通路,这些激活作用可以分别被PTX、U73122或U0126阻断;功能研究实验显示,SCIRR10是一个新型神经营养因子,痕量的SCIRR10体外可明显促进原代皮层神经元的存活;SCIRR10具有强大的促进皮层和脊髓组织块神经再生作用,体内研究显示了SCIRR10促进大鼠损伤坐骨神经的再生作用。本文一方面探讨SCIRR10蛋白功能作用位点,通过实验验证这些位点在与TRH-R2相互作用中起到关键作用,并且激活下游的信号通路;另一方面进一步证实SCIRR10与CPE的相互作用。本文的研究主要分为以下三个部分:第一部分:SCIRR10蛋白与TRH-R2作用位点的确定。通过对SCIRR10蛋白及其同源序列的计算,寻找出该蛋白存在3个作用位点:F₄₆Y₅₄Y₆₄,F₈₀Y₈₁Y₈₇,F₁₂₈Y₁₃₂Y₁₃₆。为了探讨SCIRR10蛋白位点作用方式,一方面将SCIRR10蛋白从C端开始依次进行截短,然后验证SCIRR10蛋白片段是否能与TRH-R2结合;另一方面是将SCIRR10蛋白的3个作用位点部分单独分离出来,并且将所有的苯丙氨酸（F）和酪氨酸（Y）突变为亮氨酸（L）或将苯丙氨酸突变为亮氨酸、酪氨酸突变为苯丙氨酸,然后验证正常的或者突变的作用位点短肽是否能与TRH-R2结合。1、应用PCR扩增技术、真/原核载体构建技术、GST-pull down技术、western blot技术,验证了3个从C端开始依次截短的SCIRR10蛋白片段都能够与TRH-R2相互结合。初步证明了SCIRR10蛋白3个作用位点全部或部分参与了TRH-R2的相互作用。2、荧光共振能量转移技术验证截短的SCIRR10蛋白片段和突变体是否在细胞体内与TRH-R2产生FRET现象。采集的图像数据通过统计学方法处理。实验证明,包含有F46Y54Y64位点的截短SCIRR10蛋白片段能够在细胞内与TRH-R2相互作用。其它的SCIRR10短肽与TRH-R2不能产生FRET现象。F₄₆Y₅₄Y₆₄是SCIRR10与TRH-R2关键结合部位（位点）。3、通过GFP和RFP双色荧光标记蛋白技术确定SCIRR10短肽与TRH-R2在细胞的定位分布。首先获得含有SCIRR10短肽的细胞培养基上清,将其作用于表达TRH-R2的COS-7细胞,通过激光共聚焦显微镜观察二者在细胞中的分布。包含有F₄₆Y₅₄Y₆₄位点的SCIRR10短肽与TRH-R2蛋白在细胞膜上出现了红绿荧光相互重叠的现象,其它实验组没有观察到这种现象的发生。该实验间接地证明前一个FRET实验的结果,可以说明F₄₆Y₅₄Y₆₄位点在SCIRR10与TRH-R2相互识别中起关键作用。第二部分:SCIRR10短肽对TRH-R2介导的下游信号通路作用。以PC12细胞为研究材料,检测SCIRR10短肽是否能够如同SCIRR10全长蛋白一样,刺激TRH-R2介导的下游信号通路。1、通过RT-PCR和Western blot两种不同的方法,分别从转录水平和翻译水平证明了TRH-R2存在于PC12细胞株。2、应用Western blot技术检测MAPK信号通路中的ERK1/2和Elk-1磷酸化现象的发生。SCIRR10短肽对PC12细胞进行刺激处理,包含有F₄₆Y₅₄Y₆₄位点的SCIRR10短肽能够如同SCIRR10全长和TRH一样,诱导MAPK信号通路中ERK1/2和Elk-1磷酸化水平变化。其它的实验组和阴性组却不能产生明显的变化。第三部分:SCIRR10蛋白及CPE相互作用验证。通过前期酵母双杂交技术筛选,了解到CPE能够与SCIRR10作用。为了进一步了解SCIRR10和CPE之间的相互作用。对二者进行了深入的研究。1、通过RT-PCR的方法,从大鼠脑cDNA文库中获取CPE基因全长,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His中。应用Western blot方法检测CPE蛋白的表达情况。大鼠CPE蛋白可以在COS-7细胞中得以正确表达。2、研究CPE蛋白是否能够在体外与SCIRR10蛋白相互作用。首先构建了CPE原核表达载体,然后通过Pull-Down方法,证明CPE蛋白在体外能够与CPE相互结合。3、荧光能量转移技术验证SCIRR10蛋白和CPE蛋白是否在细胞中相互作用。基于Sensitized Emmission方法,验证了SCIRR10能够在细胞内与CPE相互作用。采集的图像数据通过统计学方法处理,证明SCIRR10与CPE实验组产生的FRET现象高于阴性对照组。4、通过免疫荧光染色的方法验证SCIRR10蛋白和CPE蛋白在细胞中的定位。SCIRR10蛋白能够与Golgi体重叠标记;在SCIRR10和CPE共转染的COS-7细胞中,SCIRR10蛋白和CPE蛋白重叠标记。综上所述,SCIRR10蛋白中的F₄₆Y₅₄Y₆₄位点是与TRHR2相互作用的关键部位。包含有F₄₆Y₅₄Y₆₄位点的SCIRR10蛋白片段能够激活TRH-R2介导的下游信号通路变化。SCIRR10蛋白与CPE蛋白的相互作用通过FRET和GST pull-down得到了进一步验证,在细胞体内和体外,二者都存在相互作用。SCIRR10蛋白在Golgi体合成加工后,能够与CPE相互结合,说明CPE在SCIRR10蛋白运转过程中起到重要作用。

全文目录

缩略词表  4-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
前言  11-14
  参考文献  12-14
第一部分 SCIRR10 蛋白与 TRH-R2 作用位点的确定  14-58
  第一节 GST-pull down 验证 SCIRR10 蛋白截短体与 TRH-R2 相互作用  15-29
  第二节荧光共振能量转移验证截短的 SCIRR10 蛋白片段与 TRH-R2 相互作用  29-46
  第三节双色荧光蛋白标记截短的 SCIRR10 蛋白片段与 TRH-R2  46-55
  讨论  55-56
  结论  56
  参考文献  56-58
第二部分 SCIRR10 短肽对 TRH-R2 介导的下游信号通路作用  58-73
  第一节 PC12 细胞株中表达 TRH-R2 的验证  58-62
  第二节截短的 SCIRR10 片段及突变体对 TRH-R2 介导的下游信号通路作用  62-68
  讨论  68-69
  结论  69-70
  参考文献  70-73
第三部分 SCIRR10 与 CPE 相互作用验证  73-98
  第一节大鼠 CPE 基因的克隆及在 COS-7 细胞中的表达  73-80
  第二节 GST pull-down 验证 SCIRR10 与 CPE 相互作用  80-85
  第三节免疫荧光标记 SCIRR10 蛋白与 CPE 蛋白  85-90
  第四节荧光共振能量转移验证 SCIRR10 与 CPE 相互作用  90-95
  讨论  95-96
  结论  96
  参考文献  96-98
附录一主要仪器设备和常用试剂的配制  98-101
附录二已发表文章  101-102
附录三综述  102-110
  参考文献  106-110
图表及说明  110-112
致谢  112-113
个人简历  113

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