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FK506通过减少瘢痕形成促进周围神经再生的作用及机制研究

作　者: 阙军
导　师: 曹晓建
学　校: 南京医科大学
专　业: 外科学
关键词: FK506 瘢痕 周围神经损伤 成纤维细胞 凋亡
分类号: R651.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


FK506是1984年从链霉菌中分离出的大环内酯类抗生素,英文名tacrolimus,广泛应用于器官移植术,近年来被发现具有强大的促神经再生作用。目的第一部分：通过建立大鼠坐骨神经横断伤修复模型,探讨FK506对神经吻合口瘢痕形成的影响及其与神经再生、神经功能恢复之间的关系。第二部分：通过FK506对大鼠皮肤成纤维细胞的作用研究,探讨其减少神经吻合口瘢痕形成的机制。方法第一部分：1.建立大鼠坐骨神经横断伤修复模型,FK506按手术后4mg/kg/d灌胃；动物分组(每组15只)如下：模型组：手术后生理盐水灌胃6周；灌胃2周组：手术后FK506灌胃2周+生理盐水灌胃4周；灌胃4周组：手术后FK506灌胃4周+生理盐水灌胃2周；灌胃6周组：手术后FK506灌胃6周；正常对照组：未手术生理盐水灌胃6周。2.手术后6周取坐骨神经行MASSON染色观察胶原纤维增生情况及测量瘢痕面积(mm2)。3.手术后6周取坐骨神经行HE(Hematoxylin eosin,苏木精伊红)染色观察有髓神经纤维密度及结缔组织情况并测量有髓神经纤维密度、平均轴突直径、髓鞘厚度。4.手术后6周取坐骨神经行超薄切片、醋酸铀-硝酸铅双染后,透射电镜下观察再生神经纤维超微结构。5.手术后6周,神经标本取材完毕后,切取两侧腓肠肌,测定腓肠肌湿重恢复率(术侧与各自对侧正常肌肉比较,%)。6.手术后6周,采用de Medinaceli方法,测定坐骨神经功能指数(Sciatic Functional Index, SFI)。7.手术后6周,测定复合肌肉动作电位(compound muscle active potential, CMAP)波幅、潜伏期。8.有髓神经纤维密度及SFI与瘢痕面积进行相关性分析。第二部分：1.获取大鼠皮肤成纤维细胞并培养,5mg晶体颗粒状FK506溶解在DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)中,并保存于-20℃。含不同浓度FK506的培养基于每次实验前配制。实验分组如下：对照组：细胞以不含胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基)培育8小时；DMSO组：细胞以含DMSO的DMEM培育8小时；FK50612.5μM组：细胞以含12.5μM FK506的DMEM培育8小时；FK50625μM组：细胞以含25μM FK506的DMEM培育8小时；FK50650μM组：细胞以含50μM FK506的DMEM培育8小时；FK50675μM组：细胞以含75μM FK506的DMEM培育8小时；FK506100μM组：细胞以含100μM FK506的DMEM培育8小时；JNK(c-Jun N-terminal kinase, c-Jun氨基末端激酶)抑制剂预处理组：SP600125(40μM)预处理30分钟,继以不含胎牛血清的DMEM培育8小时；ERK(extracellular-signal regulated kinase,细胞外信号调节激酶)抑制剂预处理组：PD98059(60μM)预处理30分钟,继以不含胎牛血清的DMEM培育8小时；JNK抑制剂预处理+FK50650μM组：SP600125(40μM)预处理30分钟,继以含50μM FK506的DMEM培育8小时;ERK抑制剂预处理+FK50650μM组：PD98059(60μM)预处理30分钟,继以含50μM FK506的DMEM培育8小时。2. CCK-8(Cell Counting Kit-8,细胞计数试剂盒-8)检测不同干预对成纤维细胞活性的影响。3. Hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡形态。4.流式细胞分析技术检测细胞凋亡。5. Western blot法检测蛋白水平的表达。结果第一部分：1.FK506明显减少神经纵截面胶原纤维含量和神经横截面瘢痕面积。2.FK506明显增加神经横截面有髓纤维密度、平均轴突直径、髓鞘厚度。3.FK506明显增加有髓神经纤维的成熟度。4.FK506显著增加腓肠肌湿重恢复率。5.FK506显著改善坐骨神经功能指数,用药组较模型组恢复提前。6.FK506显著缩短复合肌肉动作电位潜伏期、提高复合肌肉动作电位波幅。7.相关性分析提示有髓神经纤维密度及坐骨神经功能都与瘢痕面积存在完全负相关关系。第二部分：1.FK506浓度依赖性的降低大鼠皮肤成纤维细胞存活率2.FK506诱导大鼠皮肤成纤维细胞产生凋亡特征性的形态学变化。3.FK506浓度依赖性的诱导大鼠皮肤成纤维细胞凋亡,并且凋亡能被JNK抑制剂SP600125或ERK抑制剂PD98059削弱。4.FK506浓度依赖性的增高大鼠皮肤成纤维细胞p-JNK(phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase,磷酸化c-Jun氨基末端激酶)、p-ERK(phosphorylation of extracellular-signal regulated kinase,磷酸化细胞外信号调节激酶)、胞浆细胞色素C及活化的caspase-3表达。5.JNK抑制剂SP600125或ERK抑制剂PD98059预处理显著降低p-JNK或p-ERK、以及活化的caspase-3的表达。结论第一部分：1.FK506能明显减少神经损伤修复后神经内胶原纤维的含量和瘢痕的面积。2.FK506能显著提高神经损伤修复后神经再生的速度和再生神经的质量。3.FK506能明显加快神经功能的恢复。4.FK506通过减少瘢痕形成促进周围神经再生和加快神经功能恢复。第二部分：1.FK506显著降低大鼠皮肤成纤维细胞存活率；2.FK506显著增高大鼠皮肤成纤维细胞凋亡率；3.FK506诱导大鼠皮肤成纤维细胞凋亡的机制可能与FK506激活JNK.ERK信号通路,使JNK和ERK磷酸化水平升高有关,而这两条信号通路激活后,经过或不经过线粒体途径,最终都引起caspase-3的活化从而导致细胞凋亡。

全文目录


缩略词表  5-7
中文摘要  7-11
ABSTRACT  11-16
前言  16-20
  参考文献  17-20
第一部分  20-44
  材料与方法  20-25
  结果  25-38
  分析与讨论  38-41
  小结  41-42
  参考文献  42-44
第二部分  44-76
  材料与方法  44-57
  结果  57-70
  分析与讨论  70-73
  小结  73-74
  参考文献  74-76
全文总结  76-77
综述  77-100
  参考文献  91-100
攻读学位期间的文章  100-101
致谢  101

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