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吗啡与氯胺酮对人离体T辅助淋巴细胞分化的影响及机制研究

作　者: 高梅
导　师: 钱燕宁
学　校: 南京医科大学
专　业: 麻醉学
关键词: 吗啡 氯胺酮 辅助T细胞 IFN-γ IL-4 T-bet GATA3
分类号: R614
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


背景：T辅助淋巴（Th）细胞的分化对免疫平衡起着重要作用，我们的前期工作已初步发现一些麻醉性镇痛药物如吗啡、氯胺酮、曲马多等对Th细胞的分化有明显影响。已知吗啡和氯胺酮均是通过其相应受体—μ受体和NMDA受体产生麻醉镇痛作用。Th细胞表面既存在μ受体，又存在NMDA受体。T-bet和GATA3分别是Th细胞向Th1和Th2细胞分化信号传导通路中重要的转录因子。在吗啡与氯胺酮影响Th细胞分化的过程中，这两个转录因子和其比值是如何变化的尚不清楚。目的：观察比较吗啡与氯胺酮对Th细胞分化的影响、μ受体和NMDA受体的作用及T-bet和GATA3活性及比值的变化，探讨其可能的作用机制。方法：10名男性健康志愿者（20-45岁，BMI15-25），分别采集空腹时外周静脉血20ml，Ficoll液分离外周血单核细胞（PBMCs）。每份血样的PBMCs均随机加入刺激剂PMA25ng/ml和离子霉素1μg/ml以及相应浓度的干预药物（吗啡、纳络酮、氯胺酮、MK801）在37°C、95%湿度、5%CO2的温箱中孵育4小时。其中吗啡的干预浓度为50ng/ml，纳络酮为25ng/ml和50ng/ml，氯胺酮浓度分别为为40μM、50μM、100μM、200μM，MK801终浓度为100μM。然后采用FACSVantageSE流式细胞仪计数Th细胞亚群百分数，用ELISA检测细胞培养上清液中的IFN-γ和IL-4的水平，用EMSA测量细胞内转录因子T-bet和GATA3与DNA结合活性。实验数据采用SPSS11.0软件的单因素方差分析或Dunnett’s T3检验。结果：1.与仅用刺激剂组比较，50ng/ml的吗啡明显降低Th1细胞数量（从16.4±4.6%到8.4±2.0%，P<0.001）和Th1/Th2比值（从3.7±1.1到1.5±0.3，P=0.002）；使IFN-γ水平(从5644.0±2105.8pg/ml到1631.8±532.7pg/ml，P=0.002)和IFN-γ/IL-4比值(从18.2±7.1到7.8±2.2，P=0.047)显著降低；同时明显降低T-bet的反应活性(从5.4±0.6到4.0±0.3，P<0.001)及T-bet/GATA3的比值(从1.6±0.2到1.2±0.1，P=0.001)。50ng/ml的纳络酮能明显消除吗啡对Th细胞向Th1细胞分化的抑制作用（从8.4±2.0%到13.9±3.6%，P<0.01）及对Th1/Th2比值的降低作用（从1.7±0.6到2.9±0.5，P<0.01）；使Th1细胞分泌的细胞因子增多，表现为IFN-γ（从1631.8±532.7pg/ml到4726.0±1105.6pg/ml，P<0.01）和IL-4（从183.6±40.1pg/ml到311.6±89.0pg/ml，P<0.05）上升及IFN-γ/IL-4比值升高（从8.7±1.4到15.4±1.9，P<0.01）；同时消除吗啡对T-bet（从4.0±0.3到5.3±0.7，P<0.01）反应活性的抑制作用，使T-bet/GATA3比值上升（从1.2±0.1到1.8±0.2，P<0.05）。2.10μg/ml的氯胺酮降低Th1（从16.4±4.6%到13.2±3.2%，P=0.072）和Th2细胞（从5.0±1.5%到2.2±0.7%，P=0.002)数量，但升高Th1/Th2比值(从3.7±1.1到6.4±1.7， P=0.011)；明显降低IFN-γ （从5644.0±2105.8pg/ml到1949.1±633.9pg/ml, P=0.004）和IL-4水平(从374.9.3±168.4pg/ml到106.3±40.7pg/ml, P=0.008)；在显著降低T-bet（从5.4±0.6到4.6±0.3，P=0.031）和GATA3反应活性（从3.3±0.3到2.2±0.3，P<0.001）同时，却明显增加T-be t/GATA3的比值(从1.6±0.2到2.0±0.3，P<0.001)。3.与仅加入刺激剂组相比，100μM浓度的MK801，能降低Th1（从17.1±2.7%到13.2±3.2%，P=0.008）和Th2（从5.0±1.6%到2.2±0.7%，P<0.001）细胞数量，但显著升高Th1/Th2比值（从3.7±1.3至6.4±1.7，P=0.001）；降低IFN-γ（从5645.0±2105.1至1949.1±633.9pg/ml， P=0.004）和IL-4（从92.3±27.3至19.9±7.0pg/ml，P<0.001）水平，有增加IFN-γ/IL-4比值的趋势（从63.5±23.2至106.7±40.9，P=0.133）；MK801明显抑制T-be（t从5.4±0.6降至4.6±0.3，P=0.031）和GATA3（从3.4±0.3降至2.2±0.3，P<0.001）的活性，但使T-bet/GATA3的比值显著增高（从1.6±0.2升至2.1±0.3，P=0.003）。4.与仅加入刺激剂组相比，氯胺酮呈剂量依赖性的降低Th1细胞（从17.1±2.7%到14.1±2.4%、P=0.22，3.1±3.3%、P=0.003和11.6±2.7%、P<0.001）和Th2细胞（从5.0±1.6%到3.6±1.0%、P=0.151，2.4±0.8%、P=0.002和2.2±0.3%、P=0.002）的数量，但增加Th1/Th2比值（从3.7±1.3到4.3±1.9、P=0.389，5.9±1.8、P=0.003和5.3±1.2、P=0.029）；而IFN-γ（从5645.0±2105.1pg/ml到3174.0±1179.6pg/ml、P=0.073，1631.8±532.7pg/ml、P=0.002和1015.3±168.9pg/ml、P=0.001）和IL-4（从92.3±27.3pg/ml到41.9±13.7pg/ml、P=0.002，20.4±7.9pg/ml、P<0.001和10.4±3.1pg/ml、P<0.001）水平也随氯胺酮浓度升高而逐渐降低；T-be（t从5.4±0.6到4.4±0.5、P<0.001，4.0±0.3、P<0.001和3.4±0.3、P<0.001）和GATA3的活性（从3.4±0.3到2.3±0.2、P<0.001，2.1±0.3、P<0.001以及1.7±0.2、P<0.001）均逐渐降低；但IFN-γ/IL-4比值（从63.5±23.2到77.4±22.9、P=0.927，90.3±39.2、P=0.635和106.8±41.6、P=0.142）和T-bet/GATA3活性比值（从1.6±0.2到1.9±0.4、P=0.054，2.0±0.4、P=0.018和2.0±0.3、P=0.008）则均呈上升趋势。结论：在PMA和离子霉素的刺激下，吗啡抑制人离体Th细胞向Th1和Th2分化，抑制IFN-γ和IL-4的分泌，降低Th1/Th2、 IFN-γ/IL-4及T-bet/GATA3比值，这一结果提示吗啡抑制Th1细胞作用甚于Th2细胞。氯胺酮在剂量依赖性降低Th细胞向Th1和Th2分化数值同时，增加Th1/Th2、IFN-γ/IL-4和T-be t/GATA3比值，提示其抑制Th2细胞甚于Th1细胞。纳络酮能消除吗啡对Th细胞分化的抑制作用，提示吗啡对Th细胞分化的影响与μ受体作用有关；MK801对Th细胞分化的影响与氯胺酮类似，提示氯胺酮对Th细胞分化的影响与NMDA受体相关。两药对T-bet/GATA3比值的影响明显不同。

全文目录


中英文对照缩略词表  4-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-11
前言  11-14
材料与方法  14-21
  试剂与仪器  14-15
  标本采集  15-16
  实验分组  16-17
  Ficoll 密度梯度离心法分离、纯化 PBMCs  17
  细胞培养  17
  Th1 和 Th2 细胞亚群的检测  17-18
  细胞培养上清液的细胞因子检测  18-19
  EMSA 测量 T-bet 和 GATA3 的 DNA 结合活性  19-20
  统计学分析  20-21
结果  21-52
  吗啡与氯胺酮对 Th 细胞的作用  21-33
  氯胺酮和 MK801 对 Th 细胞的作用  33-42
  不同浓度的氯胺酮对Th细胞的作用  42-52
讨论  52-56
  实验的可靠性分析  52-53
  实验结果分析及临床意义  53-55
  不足之处  55-56
结论  56-57
参考文献  57-64
综述  64-96
  参考文献  80-96
攻读学位期间发表文章情况  96-97
致谢  97

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中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 外科手术学 > 麻醉学
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