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海洋深层水对代谢综合征预防作用的初步研究

作　者: 何珊
导　师: 管华诗
学　校: 中国海洋大学
专　业: 药物化学
关键词: 海洋深层水矿物元素代谢综合征高脂血症 Ⅱ型糖尿病
分类号: R589
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

近年来,随着世界经济的迅猛发展,陆地资源的有限性与经济发展对资源的需求之间的矛盾日益突出,于是世界各大经济强国对资源探索的目光都不约而同的转向海洋。海洋是一座资源宝库,它不但拥有大量的矿藏、能源,同时还拥有其它众多的宝贵资源,海洋深层水(deep-sea water, DSW)正是其中之一。DSW作为一种新的天然资源正在受到世人的瞩目。DSW通常是指阳光照射不到,不能进行光合作用,约200m以深的海水。研究表明,DSW具有不少有别于海洋表层水(surface-sea water, SSW)的优良性质,如低温恒定性、矿物元素丰富且稳定及无菌清洁性等特性。药理研究表明,DSW具有多种药理活性,如预防心血管疾病(cardiovascular disease, CVD),预防和治疗肥胖病和糖尿病(diabetes mellitus, DM),治疗皮肤病,调节免疫系统及抗氧化,抗疲劳,抗肿瘤及治疗骨质疏松等,但是其作用机制尚未阐明,而且DSW的取水深度也不确定,在不同文献中DSW的取水深度不尽相同。DSW的开发利用在日本、韩国和美国已经进入商品化阶段,但我国尚无DSW方面的研究开发。随着人们生活方式和饮食习惯的改变,代谢综合征(metabolic syndrome,MS)及其相关疾病如高脂血症、Ⅱ型糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)的发病率逐年升高。研究表明,矿物元素与MS及其相关疾病的发生和发展密切相关,通过饮食补充有益矿物元素Ca、V、, Cr、Mn、Zn、Se,同时减少有毒微量元素Pb、Hg等的接触,以维持体内矿物元素含量的相对稳定,对预防MS及其相关疾病的发生具有积极意义。DSW富含92种矿物元素,涵盖了人体新陈代谢所需的元素种类,可以均衡满足机体摄取各种矿物元素的需求,因此理论上,DSW对MS及其相关疾病均具有较好的预防作用。在我国水资源日益紧缺,水污染日趋严重,MS及其相关疾病发病率逐年攀升的情况下,无论是从经济角度还是人类健康角度出发,开发和利用DSW都具有非常重要的意义及价值。本论文对我国南海海域DSW的药用价值进行了较为系统的研究,首先确定具有开发利用价值的DSW的取水深度,并在细胞和动物水平对DSW的安全性、其对MS及其相关疾病的预防作用与作用机制进行了深入研究。主要内容如下：1.具有开发利用价值的DSW取水深度的确定。研究表明,在海洋深层,海水的化学成分是相对恒定的,不随深度、季节和海域的不同而变化；同时,日本学者Miyamura M发现,与SSW相比,DSW对高脂血症的预防作用更显著。即在化学成分和药理活性方面,DSW与SSW是有区别的。因此,采用化学成分和药理活性分析相结合的方法确定具有开发利用价值的DSW的取水深度。分别汲取深度为150m,200m,300m,500m和1000m处海水,选择这5个深度的原因为150m为公认的表层,200m,300m和500m则是不同学者对海洋深层和表层的分界点,而1000m则是公认的海洋深层。首先对这5个不同深度海水的化学成分进行分析对比：采用ICP-MS测定海水中52种无机元素的含量；通过OPA-MPA柱前衍生RP-HPLC法、TPTZ分光光度法、气相色谱法及HPLC、UPLC-MS法对海水中的溶解游离氨基酸(dissolved free aminoacid, DFAA)、碳水化合物、脂肪酸和溶解有机物(dissolved organic matter, DOM)进行测定分析,并采用主成分分析和聚类分析方法对测定结果进行分析,结果表明,500m和1000m海水的化学成分非常相似,而与其他深度差异较大,说明500m及其以深的海水化学成分较为恒定。然后对不同深度的海水进行脱盐处理,制备得到硬度为1000的实验用海水,并以自由饮水的方式给予高脂乳剂造模的高脂血症大鼠,观察它们对高脂血症的预防作用及差异,结果发现,给予28天后,500m和1000m海水能显著降低高脂血症大鼠的血脂水平,提高机体抗氧化酶如SOD及GSH-Px的酶活,抑制脂质过氧化,并显著提高脂蛋白代谢酶LCAT, LPL及HL的活性,从而改善高脂血症大鼠体内的脂质代谢紊乱状态及其并发的脂肪肝和糖尿病,而其它深度海水组的各项指标则与模型对照组没有显著差异,这一结果表明500m及其以深的海水具有较好的生物活性。结合化学成分与药理活性分析结果,我们确定中国南海海域500m及其以深的海水均可用于DSW的开发利用。因为海洋的平均水深为3800m,所以海水的87%都可以用于DSW的研究开发,这一资源的数量是相当巨大的。此外,化学成分分析表明,与SSW相比,DSW富含有益微量元素V、Cr、Mn、Zn、Se等,而有毒微量元素Hg和Pb的含量则很低,而这些元素对MS及其相关疾病的发病和治疗都是有影响的,所以DSW的药理活性应该与这些元素密切相关,而这些元素在DSW和SSW中的含量差异导致了它们药理活性的差异。接下来,以取自1000m的DSW为例,对其安全性及对MS相关疾病如高脂血症及T2DM的预防作用及其作用机制进行了深入研究。2.DSW的长期毒性研究。小鼠连续饮用硬度为1000的DSW63天,结果发现,与给予自来水的空白对照组相比,其生长指标如体重、饮水量、摄食量及各项血液学指标、血液生化学指标均无差异,主要脏器的组织形态学正常,未见与药物毒性相关的明显病变。这些结果表明DSW是安全无毒的。3.DSW对脂质代谢的调节作用及机制研究。通过体外培养HepG2细胞,并采用ELISA、Western Blot等方法检测脂质代谢关键蛋白HMGCR、ACC、LDLR、 CYP7Al、Apo AI等的含量及其对AMPK及SREBPs信号通路的影响,对DSW的降脂机制进行研究。结果表明,DSW可以显著降低HepG2细胞胞内的脂质含量,对肝脏脂质代谢具有很好的调节作用。其作用机制为通过激活AMPK,磷酸化并失活胆固醇及脂肪酸合成的关建酶HMGCR和ACC,从而抑制胆固醇和脂肪酸的合成,并促进脂肪酸的氧化,同时抑制SREBP-1c的表达,进一步抑制脂肪酸及TG的合成；通过激活SREBP-2的裂解,上调LDLR的表达,提高机体清除LDL-C的能力；促进CYP7A1的表达,促进胆固醇向胆汁酸的转化；促进Apo AI的分泌,增强胆固醇的逆转运,从而在各个方面对脂质代谢进行调节。4.DSW对T2DM的预防作用及机制研究。分别在动物和细胞水平探讨了DSW对T2DM的预防作用及其机制。动物实验结果表明硬度为1000的DSW可以显著降低高脂高糖饲料联合STZ诱导的T2DM小鼠的空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)和空腹胰岛素(fasting insulin, FIns)含量,并显著提高其胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index, ISI),说明DSW可以提高T2DM小鼠的胰岛素敏感性,对T2DM具有较好的预防作用。细胞实验结果表明DSW能够明显对抗高浓度葡萄糖诱导的胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)。DSW能够激活IRS-2/PI3K信号途径,促进IRS-2的酪氨酸磷酸化及其与PI3K的p85亚基之间的相互作用,提高下游分子Akt及GSK-3的磷酸化程度,抑制G6Pase的表达,促进糖原合成,抑制糖异生而减少肝糖输出,从而抑制IR的形成。此外,DSW能够激活细胞内的AMPK信号通路,打开AMPK这个代谢“总开关”进而调节糖脂代谢,通过抑制肝脏脂质沉积改善IR。DSW还能够抑制细胞内JNK信号通路的激活,从氧化应激方面改善IR。因为IR被公认为MS的一个重要诱发因素,所以DSW对IR的改善作用表明其对MS具有较好的预防作用。同时,研究发现,人工配制的只含Mg和Ca的人工矿物质水(artificial mineral water, AMW)对脂质代谢和IR也具有一定的调节作用,而且作用机制和DSW较为相似,只是各方面的作用都较为微弱。这些结果表明DSW中的常量元素Mg和Ca对于DSW改善糖脂代谢和IR发挥了一定作用,而微量元素如V、Cr、 Mn、Zn、Se等则进一步加强了该效应,使得DSW的药理活性更为显著,因此DSW对MS及其相关疾病的预防作用应归因于其中常量元素和微量元素的联合作用,体现了多种矿物元素“协同作战”的效果。本论文首次对我国南海海域DSW对MS及其相关疾病的预防作用进行了较为系统的研究,为MS及其相关疾病如高脂血症、DM等的预防提供一个新的思路,为DSW的研究开发提供了实验基础和理论依据,并为更加全面而深入的研究开发提供了借鉴意义和启示。DSW可以通过多途径、多靶点对糖脂代谢进行调节,对MS及其相关疾病具有较好的预防作用,而且DSW具有安全无毒、资源丰富等特性,所以DSW在医药领域具有广阔的开发应用价值及前景。在当前水源污染日趋严重、水资源日益紧缺的情况下,DSW这一新资源的开发和利用必将给社会带来深远的影响,DSW将成为人类新的资源宝库。

全文目录

缩略语表  5-10
摘要  10-14
Abstract  14-21
前言  21-43
  0.1 海洋深层水的研究现状  21-27
    0.1.1 海洋深层水的定义及特性  21-22
    0.1.2 海洋深层水的安全性研究  22
    0.1.3 海洋深层水的开发利用情况  22-24
    0.1.4 海洋深层水的药理活性研究进展  24-27
  0.2 微量元素与代谢综合征相关疾病关系的研究进展  27-34
  0.3 我国海洋深层水开发的意义及前景  34-35
  0.4 课题思路与技术路线  35-38
  参考文献  38-43
第一章海洋深层水化学成分分析  43-76
  1.1 前言海洋化学分析方法  43-47
  1.2 海洋深层水化学成分分析  47-66
    1.2.1 不同深度海洋深层水的无机组分分析  47-53
    1.2.2 不同深度海洋深层水的有机组分分析  53-66
  1.3 海水淡化及淡化后化学成分分析  66-71
    1.3.1 海水淡化技术概述  66-68
    1.3.2 实验用海水的制备及其化学成分分析  68-71
  1.4 本章小结  71-73
  参考文献  73-76
第二章海洋深层水药理活性与深度的关系  76-95
  2.1 材料与仪器  77
  2.2 实验方法  77-79
    2.2.1 实验动物分组及给药  77-78
    2.2.2 实验动物生长指标观察  78
    2.2.3 血清脂质含量测定  78
    2.2.4 血清MDA、SOD、GSH-Px测定  78
    2.2.5 血清脂代谢酶活性测定  78
    2.2.6 血清载脂蛋白含量测定  78
    2.2.7 脏器系数测定  78
    2.2.8 肝脏TC和TG含量测定  78-79
    2.2.9 血清AST和ALT含量测定  79
    2.2.10 肝脏组织病理学观察  79
    2.2.11 血清FBG含量测定  79
    2.2.12 统计学处理  79
  2.3 实验结果  79-86
    2.3.1 不同深度海水对高脂血症大鼠生长指标的影响  79-80
    2.3.2 不同深度海水对高脂血症大鼠血清脂质水平的影响  80-81
    2.3.3 不同深度海水对高脂血症大鼠血清MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影响  81
    2.3.4 不同深度海水对高脂血症大鼠血清脂蛋白代谢酶活性的影响  81-82
    2.3.5 不同深度海水对高脂血症大鼠血清载脂蛋白的影响  82
    2.3.6 不同深度海水对高脂血症大鼠脏器系数的影响  82-83
    2.3.7 不同深度海水对高脂血症大鼠肝脏TC和TG的影响  83-84
    2.3.8 不同深度海水对高脂血症大鼠血清AST和ALT的影响  84
    2.3.9 肝脏组织病理学观察  84-85
    2.3.10 不同深度海水对高脂血症大鼠血糖含量的影响  85-86
  2.4 讨论  86-90
  2.5 本章小结  90-92
  参考文献  92-95
第三章海洋深层水的安全性研究  95-101
  3.1 材料与仪器  95
  3.2 实验方法  95-96
    3.2.1 实验动物分组及给药  95
    3.2.2 实验动物生长指标观察  95-96
    3.2.3 血液学指标测定  96
    3.2.4 血液生化学指标测定  96
    3.2.5 主要脏器病理学检查  96
    3.2.6 统计学处理  96
  3.3 实验结果与讨论  96-99
    3.3.1 海洋深层水对小鼠生长指标的影响  96-97
    3.3.2 海洋深层水对小鼠血液学指标的影响  97-98
    3.3.3 海洋深层水对小鼠血液生化学指标的影响  98
    3.3.4 海洋深层水对小鼠主要脏器组织形态学的影响  98-99
  3.4 本章小结  99-100
  参考文献  100-101
第四章海洋深层水对高脂血症的预防作用及其机制研究  101-127
  4.1 前言脂质代谢的信号传导途径  101-105
  4.2 材料与仪器  105-107
  4.3 实验方法  107-113
    4.3.1 HepG2细胞的体外培养  107-108
    4.3.2 MTT法检测细胞活力  108-109
    4.3.3 胞内脂质含量的测定  109
    4.3.4 HMGCR活性的测定  109-110
    4.3.5 Western blot检测脂质代谢相关蛋白表达  110-113
    4.3.6 ELISA测定Apo AI含量  113
    4.3.7 统计学处理  113
  4.4 实验结果  113-117
    4.4.1 海洋深层水对HepG2细胞增殖的影响  113-114
    4.4.2 海洋深层水对HepG2细胞胞内脂质含量的影响  114-115
    4.4.3 海洋深层水对HepG2细胞HMGCR活性的影响  115-116
    4.4.4 海洋深层水对HepG2细胞AMPK信号通路的影响  116
    4.4.5 海洋深层水对HepG2细胞SREBP-2/LDLR信号通路的影响  116-117
    4.4.6 海洋深层水对HepG2细胞CYP7A1表达的影响  117
    4.4.7 海洋深层水对HepG2细胞ApoAI分泌的影响  117
  4.5 讨论  117-121
  4.6 本章小结  121-122
  参考文献  122-127
第五章海洋深层水对Ⅱ型糖尿病的预防作用及其机制研究  127-165
  5.1 前言糖尿病及胰岛素抵抗概述  127-139
  5.2 DSW对Ⅱ型糖尿病的预防作用  139-141
    5.2.1 材料与仪器  139
    5.2.2 实验方法  139-140
    5.2.3 实验结果  140-141
  5.3 DSW对肝细胞胰岛素抵抗的改善作用及其机制研究  141-153
    5.3.1 材料与仪器  141-143
    5.3.2 实验方法  143-148
    5.3.3 实验结果  148-153
  5.4 讨论  153-157
  5.5 本章小结  157-158
  参考文献  158-165
第六章全文总结与讨论  165-169
结论与创新点  169-171
展望  171-172
致谢  172-173
个人简历  173-174
发表的学术论文  174

海洋深层水对代谢综合征预防作用的初步研究

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