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α_1-受体抗体介导的糖尿病鼠肾基质重构免疫机制

作　者: 刘晔
导　师: 赵林双
学　校: 南方医科大学
专　业: 内分泌与代谢病学
关键词: α1-肾上腺素能受体抗体糖尿病糖尿病肾病转化生长因子-β1 骨桥蛋白多沙唑嗪
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是一种发病机制极为复杂的内分泌系统疾病,已成为继癌症、心血管疾病之后的第三大威胁世界人类健康的主要疾病。目前全球约有2.5亿DM患者,预计至2030年增加到4亿,中国已成为DM第一大国,且发病趋于年轻化。DM导致的大血管、微血管等并发症是严重威胁DM患者生活质量以及造成其致残和死亡的主要因素。DM病人的各个器官和脏器都受到不同程度的损害,尤其以糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)最具有危害性。DN的常规治疗包括严格调控血糖以及使用肾素-血管紧张素系统抑制剂严格控制血压。然而,在临床实践中,虽然应用上述治疗很好地控制了血糖和血压,仍有很多患者的肾脏未达到预期的保护目的。仅用血液动力学障碍、高血糖等方面解释DN是不充分的,免疫机制在其并发症的发病机制中占有重要地位。近年来发现,AT1、α1、βl、M2等受体自身抗体(Autoantibodies, Auto Ab)阳性的患者即使血糖、血压控制在正常范围内,其DN发病率及病程进展方面都远远高于Auto Ab阴性的患者。因此,我们推测DN发病可能与Auto Ab有关,但此抗体(Antibodies, Ab)参与DN发病的肾脏改变机制尚不清楚。有研究提出把DN看作一种由代谢紊乱引起的炎症性疾病。肾脏固有细胞在病理状态下可产生核因子-κB(Nuclear factor kappa B, NF-κB)、骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)等多种促炎症因子或炎症因子,这些因子又通过自分泌和旁分泌等方式使炎症效应不断的扩大,引起炎症的级联反应。其中,NF-κB起主要调节作用。活化的NF-κB不仅可以自身激活转化生长因子-α(Transforming growth factor-α, TGF-α)、白细胞介素-1(Interleukin-1, TL-1)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)等导致肾小球肥大、肾小球率过滤增加、肾小球基底膜增厚、肾小球系膜细胞增生、炎症细胞的沉积、细胞外基质(Extracelluarmatrix, ECM)沉积等,活化的NF-κB还可通过诱导OPN、TGF-β1等炎症因子的产生引起炎症的级联反应,将炎症扩大化；OPN自身也可导致肾基质重构,例如早期肾实质的损伤造成肾小球滤过大量蛋白尿,进入肾小管通过OPN诱发肾脏间质炎性浸润；TGF-β1是目前公认的最重要的致纤维化因子之一,可从多方面促进ECM生成,同时抑制其降解,导致其过度集聚,最终引起相关组织的纤维化。正常情况下,NF-κB的以P50-P65组成的异二聚体的形式与抑制蛋白IKBa结合存在于几乎所有细胞的胞浆中,只有P65在核内极少表达维持正常的生理活动。而在TGF-β1、蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)等因子的激活下,P65移位至胞核,导致NF-κB大量表达。其中PKC为G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor, GPCR)下游的信号转导分子,而血清α1-肾上腺素能受体抗体(α1-Adrenergic receptor antibodies, α1-RAb)为GPCR对应的Ab。GPCR是与GTP结合蛋白偶联的一组膜表面糖蛋白,其包括AT1、α1、β1M2受体等,是涉及信号转导的细胞膜受体中最大的家族,介导的信号参与肾脏功能和调节免疫应答。GPCR由7个多肽链形成的跨膜亚单位构成,形成三个细胞外环和三个细胞内环的空间构象,α1-R Ab为IgM或IgG型免疫球蛋白,主要针对α1-R胞外第二肽段的1922218氨基酸序列。研究发现,此GPCR受到反复刺激后可通过内化机制产生Auto Ab,模拟正常的生理信号如血管紧张素(Angiotensin, AT)、肾上腺素,激动相应GPCR,发挥与血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, ATⅡ)、肾上腺素等相似作用。α1-R Ab与受体结合后,可能通过α1-R Ab→GPCR→PKC→NF-κB→TGF-β1,或α1-R Ab→GPCR→PKC→NF-κB→OPN→TGF-β1信号转导通路的激活调节肾皮质相关细胞增殖、分化、代谢等多方面的应答。所以,我们设计此实验,鼠尾静脉注射α1,-RAb,研究此受体Ab介导后,通过激活GPCR继而活化NF-κB最终激活TGF-β1、OPN等炎症因子使炎症效应不断扩大,引起炎症的级联反应。随着炎症反应和免疫反应在DN进展中关键作用的确立,如何阻断DN并发症机制中这一关键环节,早期保护肾功能成为目前研究热点。免疫机制链接炎症因子导致肾基质重构及受体Ab阻断剂干预DN的发展目前尚未见报道。本实验建立DM大鼠模型,探讨α1-RAb与TGF-β1、OPN在DN进展中的重要作用及多沙唑嗪对其的相关影响,为临床治疗体内存在或高度表达自身Ab的患者提供了新的理论依据,也为将来开发DN的分子靶向治疗开拓了新思路。第一章α1-肾上腺素能受体抗体介导对糖尿病鼠肾皮质转化生长因子-p1表达的影响[目的]观察α1-R Ab的介导对DM大鼠肾皮质中TGF-β1表达的影响,通过探讨其在肾皮质病变中的发生发展,以阐明α1-RAb在肾基质重构中的作用。[方法]1.高脂饲料的制作：10%猪油,10%蔗糖,2.5%胆固醇,0.4%胆酸钠和77%基础饲料混匀后压粒即得。2.DM大鼠模型的制备与实验动物分组：Wistar大鼠适应性喂养一周后,称重,随机分为健康鼠空白对照组、健康鼠α1-R Ab介导组、DM鼠无α1-R Ab介导组及DM鼠α1-RAb介导组。DM鼠高糖高脂饮食喂养四周后,造模前禁食12h,后以体重0.5mL／100g体重腹腔注射配置好的无菌柠檬酸-链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)混合液[临用前用0.1mol／L的柠檬酸钠缓冲液(pH=4.3)配成20g／L浓度],72h后鼠尾静脉取血测定空腹血糖,血糖>16.7mmol／L为造模成功。造模成功后：健康鼠α1-RAb介导组、DM鼠α1-RAb介导组在0、4、8、12、16周鼠尾静脉一次性注射α1-RAb,100μg／100g体重；健康鼠空白对照组、DM鼠无α1-RAb介导组在0、4、8、12、16周鼠尾静脉一次性注射等量注射用生理盐水。DM鼠组造模成功后改为普食喂养至实验结束。对照组全过程普食喂养。实验期间,保持室温18-20℃,湿度69%,12h交替照明,大鼠自由饮水、进食。3.疗效观察与检测：①一般情况的影响：包括活动、精神状态、皮毛状况、摄食量、饮水量、大小便、体重等的观测。②对大鼠24h尿白蛋白定量(24hour urine protein,24hUpro)[放射免疫分析法(Radioimmunoassay, RIA)]、血清肌酐值(Serum creatinine, SCr)(苦味酸法)的影响。4.免疫组化法研究TGF-β1在正常大鼠和DM大鼠肾脏组织的分布和表达情况。5.电镜下观察各实验组肾组织近曲小管、远曲小管及肾小球的改变。[结果]1.32只大鼠用于造模,成模率100%(32／32),成模后病死率为零(0／32)。2.16周介导后,健康鼠体重较介导前增多有显著性意义(P=0.000),DM鼠体重较前减少有显著性意义(P=0.000)。3.16周介导后,健康鼠24hUpro增多有显著性意义(P=0.011或P=0.000)。DM鼠α1-RAb介导后SCr增多有显著性意义(P=0.000),健康鼠α1-RAb介导后SCr差异无显著性意义(P=0.383)。4.由平均灰度、阳性单位评估TGF-β1表达程度。有或无α1-RAb介导的健康鼠组和DM鼠组肾皮质中均可见TGF-p1的表达,且α1-RAb介导组较无α1-RAb介导组增多有显著性意义(P=0.000或P=0.001或P=0.006或P=0.010)。5.电镜下健康鼠空白对照组未见明显异常,健康鼠α1-RAb介导组及DM鼠无α1-R Ab组可见轻度异常,DM鼠α1-R Ab介导组微观结构严重的破坏。[结论]α1-RAb介导的鼠体肾皮质中TGF-p1表达增加,即TGF-β1的表达与α1-RAb介导的免疫反应有关。第二章α1-肾上腺素能受体抗体介导对糖尿病鼠肾皮质骨桥蛋白表达的影响[目的]观察α1-RAb的介导对DM大鼠肾皮质中OPN表达的影响,通过探讨其在肾皮质病变中的发生发展,以阐明α1-RAb在肾基质重构中的作用。[方法]同第一章。[结果]由平均灰度、阳性单位评估OPN的表达程度。有或无α1-RAb介导的健康鼠组和DM鼠组肾皮质中均可见OPN的表达,且α1-RAb介导组较无α1-RAb介导组增多有显著性意义(P=0.000)。余结果同第一章。[结论]α1-RAb介导的鼠体肾皮质中OPN表达增加,即OPN的表达与α1-RAb介导的免疫反应有关。第三章多沙唑嗪对血清α1-肾上腺素能受体抗体介导的糖尿病鼠肾皮质转化生长因子-β1表达的影响[目的]通过观察多沙唑嗪抑制α1-R Ab介导的DM大鼠肾皮质中TGF-β1的表达,探讨其对α1-R Ab介导的DM大鼠肾皮质中TGF-β1表达的抑制作用,来进一步阐明α1-R Ab抑制剂是否可以通过降低促纤维化因子TGF-p1的表达,减轻肾基质重构,从而延缓DN的发生。[方法]1.高脂饲料的制作：同第一章。2.灌胃药物的制作：多沙唑嗪(4mg),研磨成粉末状后按0.36mg／kg给药剂量、10ml／kg大鼠给药容量配置既得。3.DM大鼠模型的制备与实验动物分组：Wistar大鼠适应性喂养一周后,高糖高脂饮食喂养四周,造模前禁食12h,后以体重0.5mL／100g体重腹腔注射配置好的无菌STZ混合液[临用前用0.1mol／L的柠檬酸钠缓冲液(pH=4.3)配成20g／L浓度],72h后鼠尾静脉取血测定空腹血糖,血糖>16.7mmol／L为造模成功。造模成功后,称重,随机分为DM鼠无α1-RAb介导组、DM鼠α1-RAb介导组、DM鼠α1-RAb介导+多沙唑嗪干预组及DM鼠多沙唑嗪干预组。DM鼠α1-RAb介导组、DM鼠α1-R Ab介导+多沙唑嗪干预组在0、4、8、12、16周鼠尾静脉一次性注射α1-R Ab,100μg／100g体重；DM鼠无α1-R Ab介导组、DM鼠多沙唑嗪干预组在0、4、8、12、16周鼠尾静脉一次性注射等量生理盐水；DM鼠α1-RAb介导+多沙唑嗪干预组、DM鼠多沙唑嗪干预组按0.36mg／kg给药剂量、10ml／kg大鼠给药容量灌胃给药,DM鼠无α1-RAb介导组、DM鼠α1-RAb介导组给予相应体积的蒸馏水,1／d,连续16周。DM鼠组造模成功后改为普食喂养至实验结束。对照组全过程普食喂养。实验期间,保持室温18-20℃,湿度69%,12h交替照明,大鼠自由饮水、进食。4.疗效观察与检测：同第一章。[结果]1.48只大鼠用于造模,成模率100%(48／48),成模后病死率为零(0／48)。2.16周α1-RAb介导后,DM鼠体重较前减少有显著性意义(P=0.000)。3.16周α1-RAb介导后,DM鼠a1-RAb介导组24hUpro、SCr水平较DM鼠无α1-RAb介导组增多有显著性意义(P<0.01)；DM鼠a1-RAb介导+多沙唑嗪干预组24hUpro、SCr水平较DM鼠α1-R Ab介导组减少有显著性意义(P<0.01)。DM鼠多沙唑嗪干预组24hUpro较DM无α1-RAb介导组减少有显著性意义(P<0.01),SCr水平差异无显著性意义(P=0.249)。4.由平均灰度、阳性单位评估TGF-β1的表达程度。有或无α1-RAb介导的DM鼠肾皮质中均可见TGF-β1的表达,α1-RAb介导组较无α1-RAb介导组增多有显著性意义(P<0.01),α1-R Ab介导+多沙唑嗪干预组较α1-R Ab介导组减少有显著性意义(P<0.01),多沙唑嗪干预组较无α1-R Ab介导组减少有显著性意义(P<0.01)。5.电镜下DM鼠无α1-R Ab组可见轻度异常,DM鼠α1-R Ab组微观结构严重破坏,DM鼠α1-R Ab介导+多沙唑嗪干预组较DM鼠α1-R Ab介导组显著好转,DM鼠多沙唑嗪干预组稍有异常。[结论]TGF-β1的表达与自身免疫有关。多沙唑嗪可抑制α1-RAb介导的DM鼠肾皮质中TGF-β1的表达。

全文目录

摘要  3-10
ABSTRACT  10-21
前言  21-33
  参考文献  28-33
第一章血清α_1-肾上腺素能受体抗体介导对糖尿病鼠肾皮质转化生长因子-β_1表达的影响  33-54
  1 材料和方法  33-36
  2 结果  36-42
  3 讨论  42-45
  参考文献  45-48
  附图  48-54
第二章血清α_1-肾上腺素能受体抗体介导对糖尿病鼠肾皮质骨桥蛋白表达的影响  54-70
  1 材料和方法  54-57
  2 结果  57-63
  3 讨论  63-66
  参考文献  66-68
  附图  68-70
第三章多沙唑嗪对血清α_1-肾上腺素能受体抗体介导的糖尿病鼠肾皮质转化生长因子-β_1表达的影响  70-88
  1 材料和方法  70-74
  2 结果  74-80
  3 讨论  80-83
  参考文献  83-84
  附图  84-88
全文小结  88-90
综述  90-97
  参考文献  94-97
攻读硕士期间成果  97-98
中英文对照缩略词表  98-100
致谢  100-102
统计学证明  102

α_1-受体抗体介导的糖尿病鼠肾基质重构免疫机制

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