学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

肝纤维化发生发展及逆转过程中kupffer细胞表型的研究

作　者: 陈芳艳
导　师: 贺福初; 姜颖
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肝纤维化 Kupffer细胞流式细胞仪分选 CCl4诱导 kupffer细胞亚型
分类号: R575.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 80次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

Kupffer细胞（KCs）是位于肝窦状隙内的一类非实质细胞，是机体内单核-巨噬细胞系的成员，属于定居于肝内的巨噬细胞，虽只占肝细胞总数的15%左右，但占单核-巨噬细胞系总数的80％-90％，它们主要位于小叶门静脉区，起重要的防御功能。KCs在生理和病理条件下都具有重要功能，针对KCs的相关实验研究越来越引起人们的重视。KCs不仅能非特异的吞噬和清除血液中的细菌、外源性异物等抗原性物质，而且还具有特异性的免疫应答、抗肿瘤免疫反应、内毒素解毒、抗感染、调节微循环及物质代谢等方面的作用。病理条件下，KCs可被内毒素、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等激活，释放TNF、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）、干扰素（IFN）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、氧自由基（oxygenfree radical，OFR）、一氧化氮等炎性介质，这些炎性介质均参与了肝损伤的发生与发展。KCs是一类异质性非常强的巨噬细胞，在不同的微环境条件下具有不同的表型，即KCs可分为多种亚型，且功能不同。目前公认的巨噬细胞亚群主要为M1型和M2型两大类。在Th1型细胞因子（例如γ—IFN、TNF-α）作用下，巨噬细胞极化成经典激活的巨噬细胞（CAMφ），即M1型巨噬细胞。而在Th2型细胞因子（例如IL4/IL13）作用下，极化成选择性激活的巨噬细胞（AAMφ），即M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞的主要功能是清除细胞外病原体和促进炎症反应，合成和分泌TNF-α、IL-1、IL-6等促炎细胞因子，通过iNOS将精氨酸代谢成NO来杀灭病原体。而M2型巨噬细胞的主要功能是抑制炎症反应和参与组织修复，合成和分泌抗炎细胞因子IL-10以及通过精氨酸酶-1将精氨酸分解成聚胺，参与合成和稳定细胞外基质，且近年来也有人提出M2型KCs又可分为M2a、M2b及M2c三种亚型。但是在肝纤维化动物模型中，体内KCs亚群的分类还不清楚。肝纤维化是由持续性损伤-修复反应引起的，导致肝组织内细胞外基质异常沉积，进一步引发肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程，属于肝硬化的早期阶段，已有大量研究表明肝纤维化在去除损伤因素后是可以逆转的。肝星状细胞作为主要的效应细胞，合成和分泌各种胶原和细胞外基质，一直被认为是肝纤维化发生发展的中心环节。然而，已有研究者发现巨噬细胞作为主要的调节细胞，能同时调节肝星状细胞的功能和基质胶原的降解。在肝纤维化形成过程中，巨噬细胞激活静息状态的肝星状细胞促进肝纤维化的形成，在肝纤维化逆转过程中，促使活化的肝星状细胞凋亡和纤维胶原的降解，促进肝纤维化的逆转。目前已有研究表明在肝纤维化发生发展及逆转中的双向调节作用是由不同的巨噬细胞亚群调控的，但是关于巨噬细胞亚群的分类在动物模型体内还没有系统的研究，而肝脏巨噬细胞（KCs）在肝纤维化中的作用越来越受到关注。我们的研究目的是找到何种表型的KCs分别在肝纤维形成期和逆转期中发挥主要调节作用，为深入研究KCs在肝纤维化疾病中的分子机制奠定基础。肝纤维化的深入研究对预防和缓解肝纤维化病情具有重要的临床意义。我们首先建立流式细胞术同步分选KCs亚型细胞方法，通过多种细胞表面特异标志物的联合使用区分各亚型细胞，并同时获得这些亚型细胞。流式分选后KCs（F4/80+）得率为（1.26±0.24）×106/小鼠，纯度为（97.6±0.7）%，LSEC（CD146+）污染度为（0.5±0.3）%，T淋巴细胞（CD3+）污染度小于0.5%，细胞纯度、活性及得率均能满足后续体外功能验证研究和进一步的蛋白质组学分析。然后建立CCl₄诱导的小鼠肝纤维化模型，分离纯化急性炎症期、肝纤维化形成期及逆转期的KCs，应用流式细胞术分析各时期KCs表达的表面标志物的差异，应用qRT-PCR检测各时期KCs中炎性细胞因子和纤维化相关的细胞因子的表达差异，以确定各时期KCs的表型。第一次注射CCl₄后，小鼠血清中ALT和AST水平显著升高，尤其是注射后48h时达到最大值，HE染色显示炎性细胞数目显著增加，肝细胞气球样变性，损伤严重，Masson染色显示胶原纤维含量没有增加。实验结果表明第一次注射CCl₄后，小鼠肝脏中发生严重的急性损伤反应，导致大量肝细胞坏死。连续注射CCl₄的过程中，血清中ALT和AST水平逐渐升高但低于急性损伤期，肝脏中胶原纤维含量逐渐增加，肝组织中α-SMA表达量也逐渐增加，并伴随着慢性炎症反应，表明CCl₄诱导小鼠肝纤维化模型构建成功。停止注射CCl₄后，随着自然恢复时间的延长，血清中ALT和AST水平逐渐恢复正常水平，肝组织中α-SMA表达量也显著下降，接近正常小鼠表达水平，胶原纤维虽然消除缓慢，但在自然恢复6周（R6W）时各项指标均接近正常水平。说明停止注射CCl₄后，肝纤维化小鼠发生自然恢复反应且可以自然恢复到接近正常水平，如果自然恢复时间再延长，可以恢复到正常水平。肝纤维化模型构建成功后，通过检测肝内KCs的数量变化和细胞因子表达情况确定KCs参与肝纤维化发生发展及逆转过程。肝纤维化发生发展过程中肝内KCs数量显著增加，肝纤维化逆转过程中肝内KCs数量逐渐减少，趋向与正常。KCs通过分泌不同的细胞因子在肝纤维化发生发展及逆转过程中实现双向调节作用。实验结果表明急性炎症期肝内固有KCs（CD45+F4/80hi）主要功能是募集肝外单核细胞进入肝脏，表达炎性细胞因子，促进炎症反应，导致肝损伤，而肝外来源的KCs（CD45+F4/80low）主要功能是促进肝星状细胞活化和表达纤维化相关细胞因子促进肝纤维化发生发展；正常肝脏KCs是M2b型；肝纤维化发生发展及逆转过程中发挥主要作用的KCs表型不同，存在各亚型KCs的表型转换；急性炎症期、肝纤维化形成过程中、肝纤维化逆转过程中发挥主要作用的KCs分别是M1型、M2c型、M2a型。我们首次系统地研究了生理条件下和肝纤维化发生、发展及逆转过程中KCs表型的鉴定，并发现不同表型的KCs之间存在表型的转换，初步明确不同时期KCs的表型，为进一步研究引起发挥不同生物学功能的KCs表型转变的分子机制以及进一步开发抗纤维化治疗新靶点提供研究基础，对肝纤维化的治疗具有重要的临床意义。但是本研究仅描述了在肝纤维化不同时期发挥不同生物学功能的Kupffer细胞具有不同的表型这个现象，没有进一步探讨其机理。

全文目录

英文缩写词对照表  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
绪论  12-18
  参考文献  16-18
第一章 CCl_4诱导小鼠肝纤维化模型建立与评估  18-31
  1 材料与方法  19-22
    1.1 材料与主要试剂  19
    1.2 主要仪器设备  19
    1.3 CCl_4诱导小鼠肝纤维化方法及实验动物分组处理  19-20
    1.4 小鼠血清中 ALT、AST 含量检测  20
    1.5 肝组织石蜡切片制备  20-21
    1.6 Masson 染色  21
    1.7 HE 染色  21
    1.8 肝组织全蛋白提取  21-22
    1.9 Western blotting  22
  2 结果与讨论  22-28
    2.1 检测小鼠血清中 ALT、AST 含量，反应肝细胞损伤程度  22-23
    2.2 检测肝组织中α-SMA 的表达  23-24
    2.3 HE 染色和 Masson 染色分析  24-28
  3 小结  28
  参考文献  28-31
第二章流式细胞术分选小鼠原代 kupffer 细胞及评价  31-40
  1 材料与方法  32-35
    1.1 材料与主要试剂  32
    1.2 主要仪器设备  32
    1.3 原代 kupffer 细胞分离与纯化  32-33
    1.4 kupffer 细胞纯度、污染度及活性检测和形态观察  33-35
  2 结果与讨论  35
    2.1 kupffer 细胞纯度，活性，形态观察及其他细胞污染度检测  35
  3 小结  35-37
  参考文献  37-40
第三章肝纤维化发生发展及逆转过程中 kupffer 细胞的表型研究  40-63
  1 材料与方法  41-45
    1.1 材料与主要试剂  41-42
    1.2 主要仪器设备  42
    1.3 流式细胞术检测 kupffer 细胞表面标志物  42
    1.4 Kupffer 细胞总 RNA 提取及反转录  42-43
    1.5 qRT-PCR  43-45
  2 结果与讨论  45-58
    2.1 肝纤维化发生发展及逆转过程中，肝内 kupffer 细胞数目及细胞群分析  45-49
    2.2 肝纤维化发生发展及逆转过程中，kupffer 细胞中炎性和纤维化相关细胞因子含量检测  49-54
    2.3 肝纤维化发生发展及逆转过程中，kupffer 细胞表型检测  54-58
      2.3.1 正常小鼠肝脏 kupffer 细胞的表型为 M2b 型  54-55
      2.3.2 M1 型 kupffer 细胞存在于 CCl_4诱导的急性炎症期，肝纤维化形成早期和肝纤维化逆转早期  55-56
      2.3.3 M2c 和 M2a 型 kupffer 细胞存在于肝纤维化发生发展及逆转过程  56-58
  3 小结  58-59
  参考文献  59-63
结论  63-65
综述  65-74
  参考文献  71-73
  同一课题组两篇Nature 文章解释组蛋白修饰调节转录的新机制  73-74
个人简历及攻读期成果  74-75
致谢  75-76

肝纤维化发生发展及逆转过程中kupffer细胞表型的研究

内容摘要

全文目录

相似论文