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靶向脂筏及AMPK杀伤CML细胞的作用与机制研究

作　者: 严俊
导　师: 吴祖泽; 王立生
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: CML BCR-ABL 联合作用 MβCD Compound C
分类号: R733.72
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

慢性粒细胞白血病(CML)是一种源于多能骨髓干细胞的骨髓增生性肿瘤,其主要的病理基础是t(9;22)染色体易位导致bcr-abl融合基因的产生。Bcr-abl基因编码具有酪氨酸激酶活性融合蛋白,能持续激活下游促增殖信号并导致肿瘤发生。针对这一机制开发的药物——酪氨酸酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors, TKIs),如伊马替尼(Imatinib)在临床上已经得到了广泛应用。然而,由于bcr-abl基因点突变以及肿瘤干细胞的乏敏感性等因素仍然导致40%左右的CML病人在接受TKI靶向治疗后产生耐药。因此,克服药物耐受成为了当前临床治疗中亟待解决的一个课题。越来越多的证据表明,两种或多种药物的联合应用对克服耐药具有显著效果。由于肿瘤的发生和耐药是一个多系统多信号的过程,利用抑制剂阻断相关组分和信号的正常运行,可以促进肿瘤药物的杀伤效果及有效抑制耐药。新的治疗靶点成为克服CML耐药关键环节,如组蛋白酶体抑制剂和Imatinib联合作用能有效杀灭CML干细胞。脂筏是细胞膜磷脂双分子层中重要的功能微区,其包含跨膜蛋白、离子通道和细胞因子受体等物质,能够改变下游酶蛋白和信号分子的活性,参与调节细胞的功能。腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)是细胞能量的传感器,也是调控能量代谢的主要调节器。本研究从药物联合应用解决耐药的角度出发,以BCR-ABL+慢性粒细胞白血病细胞为模型,分别探讨了脂筏抑制剂MβCD和临床药物Imatinib对CML的联合作用,以及AMPK抑制剂Compound C和潜在药物白藜芦醇(Resveratrol)在杀伤CML中的联合应用。首先,我们利用MβCD来抑制脂筏,进而探讨其对Imatinib敏感和耐受的CML细胞的作用,以及与Imatinib的联合作用。我们检测了MβCD对表达BCR-ABL的CML细胞K562及其耐药细胞K562R的增殖影响,结果发现MβCD在1mM浓度作用24h后,显著抑制细胞活性、集落形成能力并引起G2/M期阻滞。利用FITC-Annexin V/PI双染法及Western Blot法证明MβCD具有诱导K562和K562R细胞凋亡的作用。同样,Western Blot和免疫荧光结果也证实了MβCD能够诱导CML细胞自噬发生。接着,用Western Blot和酶活试剂盒分别检测了MβCD作用于细胞后ERK和SPK1的表达和活性情况。结果发现MβCD显著抑制ERK和SPK1的表达和活性。为进一步确定SPK1是否介导MβCD诱导的细胞凋亡,我们利用携带spk1基因的腺病毒感染K562细胞,并就MβCD诱导过表达SPK1细胞的凋亡进行检测。结果显示,过表达SPK1组MβCD诱导的凋亡率要明显少于对照组。从而证明了ERK/SPK1信号参与并部分介导MβCD诱导细胞凋亡的作用。由于具有酪氨酸激酶活性的BCR-ABL蛋白也受到脂筏信号池的调节,因此我们提出假设:MβCD与Imatinib的联合作用能否更加有效地治疗BCR-ABL+CML细胞,甚至耐药细胞包括bcr-abl点突变的细胞?为验证该假设,我们不仅观察到MβCD与Imatinib联合作用可以抑制K562和K562R细胞的增殖、诱导凋亡和自噬,而且证明两者联合应用对表达BCR-ABLT315I的BaF3细胞也具有协同诱导凋亡的作用。最后,通过检测BCR-ABL及其底物p-CrkL的表达、ERK及其靶蛋白C-MYC和SPK1的表达与活性,证明MβCD与Imatinib通过协同调节ERK/SPK1信号来发挥作用。上述结果提示,MβCD不仅自身对BCR-ABL+CML细胞具有杀伤作用,而且还能与临床药物Imatinib联合发挥协同作用。AMPK是细胞能量代谢的关键调控分子,在维持肿瘤细胞稳态中扮演重要角色。AMPK的激动剂二甲双胍(Metformin)、氨基咪唑-4-酰胺核苷(AICAR)以及白藜芦醇(Resveratrol)都被证实具有明显的抑癌作用。然而AMPK介导的保护作用仍然是细胞产生耐药的关键因素。因此,我们推测抑制AMPK可能会有利于上述激动剂更好地发挥抗癌作用。为此,我们引入AMPK的选择性抑制剂Compound C进行了相关研究。首先,我们观察了Compound C单独作用对CML细胞功能的影响。CCK-8法和集落形成实验都证明Compound C可以明显抑制CML细胞的增殖。FITC-Annexin V/PI双染法、JC-1法、电镜和剪切型Caspase3表达检测都表明,Compound C对CML细胞具有凋亡诱导作用,其诱导的细胞凋亡不仅与线粒体途径有关,还部分依赖于Caspase途径。另外,通过MDC染色、免疫荧光和电镜的方法证实了Compound C对CML细胞的自噬诱导作用。分别用自噬药物抑制剂3-MA、CQ以及RNA干涉的方法抑制Compound C诱导的自噬后,发现凋亡水平有明显的提高,说明Compound C诱导的是保护性自噬。为明确AMPK是否介导Compound C对CML的作用,我们分别加入AMPK激动剂AICAR,以及转染AMPK siRNA后进行研究。结果显示,AICAR未能逆转Compound C诱导的凋亡和自噬,且干涉AMPK后反而促进了Compound C引起的凋亡和自噬,表明AMPK可能并不参与Compound C诱导的凋亡和自噬过程。接着,我们研究了Compound C与Resveratrol联合作用对CML细胞的影响。结果显示,两者联合使用能显著抑制K562和K562R细胞的增殖,另外对BCR-ABL+CML细胞和表达BCR-ABLT315I的BaF3细胞诱导的细胞凋亡均有叠加效应。Western Blot检测P-STAT5、P-AKT、P-CrkL等分子表达的结果均证实Compound C与Resveratrol联合作用是通过抑制促增殖信号分子的表达和活性来发挥的。上述结果说明Compound C与Resveratrol两者联合应用的效果要优于单一用药。而应用激动剂AICAR和siAMPK作用后的检测结果表明,AMPK可能并非Compound C或Resveratrol药物作用CML细胞的必需途径。综上所述,本课题以BCR-ABL+CML细胞为研究对象,分别对两种抑制剂M?CD和Compound C通过克服肿瘤细胞耐药而发挥的潜在抗癌作用,以及其在药物配伍中的价值进行了研究分析,期望为CML的临床药物治疗提供富有意义的实验依据。

全文目录

英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
前言  14-17
第一部分 MβCD 对慢粒白血病细胞的功能影响及机制初探  17-35
  1. 实验材料  17-18
  2. 实验方法  18-20
  3. 实验结果  20-31
  4. 讨论  31-35
第二部分 MβCD 与 Imatinib 对 BCR-ABL~+ CML 细胞的联合作用  35-47
  1. 实验材料  35-36
  2. 实验方法  36
  3. 实验结果  36-44
  4. 讨论  44-47
第三部分 Compound C 诱导 CML 细胞凋亡和保护性自噬  47-65
  1. 实验材料  47
  2. 实验方法  47-49
  3. 实验结果  49-63
  4、讨论  63-65
第四部分 Compound C 和 Resveratrol 联合作用 BCR-ABL~+ CML 细胞  65-75
  1. 实验材料  65
  2. 实验方法  65
  3. 实验结果  65-72
  4、讨论  72-75
总结  75-77
参考文献  77-83
文献综述  83-88
个人简历  88-90
致谢  90

靶向脂筏及AMPK杀伤CML细胞的作用与机制研究

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