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动脉粥样硬化( atherosclerosis, AS)是众多心脑血管疾病共同的病理基础,也是心血管系统疾病中最常见的疾病,严重危害人类健康。AS的发病机制存在多种学说,但任何一种学说均不能全面的解释AS的发生发展。近年来大量细胞及分子水平的实验研究表明尽管AS的致病因素多种多样,但是AS所导致的是一条相似的发展途径即慢性炎症病理过程。血管内皮受损,脂质氧化及浸润,血小板、炎性细胞活化、粘附并浸润,平滑肌细胞迁移、增殖等伴随着AS发生、进展、恶化及斑块破裂并血栓形成的全过程。针对AS的发展特点,我们考虑是否可以通过构建多靶点的治疗药物,针对不同病理过程从多个方面抑制AS的进展。研究表明炎症贯穿于动脉粥样硬化发生和发展的全过程,是动脉粥样硬化过程中许多病理生理改变的共同基础。凝血酶和血小板作为参与凝血过程的重要因子是多种抗凝药物作用的靶点,同时越来越多的研究表明在动脉粥样硬化发生发展过程中血管损伤处聚集的凝血酶,血小板对血管壁炎症反应具有重要促进作用。由于局部凝血功能亢进在损伤内皮表面常常有纤维蛋白形成的网状结构出现,在这种网状结构中聚集了大量血小板,白细胞,凝血酶等,这些物质的存在加剧了损伤血管处的炎症反应促进了动脉粥样硬化的发展。由此可见凝血酶和血小板同时参与了凝血及炎症两个反应过程。在AS发展的晚期,患者常常伴有冠状动脉综合征的症状,临床应用抗凝及溶栓治疗。因此我们设计构建了多功能融合蛋白SRH,针对抗凝、抗炎及溶栓三个方面实现抗AS的作用。天然葡激酶(staphylokinase, SAK)可以选择性地作用于纤维蛋白原,具有纤维蛋白特异性高,对血小板富集型血栓作用强,副作用小,价格便宜等优点。我室研制的rSAK已经完成临床试验评价,研究结果表明,rSAK的再通率显著高于r-tPA,显示出良好的临床应用前景。因此我们设计了以SAK为骨架的多功能融合蛋白SRH,其分子结构主要包括三个部分:SAK分子,RGD序列,水蛭素12肽。SAK主要发挥其溶解纤维蛋白的作用,RGD序列具有抑制血小板聚集功能,水蛭素12肽具有抗凝血酶功能。本研究的主要内容包括以下四个部分一利用重叠延伸PCR方法,在SAK突变体的基础上构建了SRH融合蛋白基因,将编码融合基因的DNA片段重组入表达载体pBV220,转化E.coli BL21感受态细胞进行诱导表达。结果显示,SRH在E.coli/pBV220受体菌中主要以可溶性形式表达。将E.coli BL21/pBV220-SRH菌株进行发酵,大量表达后,进行纯化。经过阴离子交换层析和凝胶过滤层析两步纯化,SRH纯度达95%以上。我们进一步对融合分子SRH的各个功能域进行了功能检测分析,使用纤维蛋白平板溶圈法,底物发色法等检测SRH溶栓活性,结果显示SRH蛋白溶栓活性为(1.3±0.15)×104 AU/mg低于SAK(4.1±0.12)×104 AU/mg;ELISA检测SRH蛋白结合凝血酶能力,结果显示SRH蛋白具有结合凝血酶的能力,进一步使用纤维蛋白凝块法检测SRH的抗凝血酶功能,结果显示与SAK相比SRH蛋白具有显著抗凝血酶功能;检测SRH的抗血小板聚集功能结果显示SRH蛋白保持了RGD序列的抗血小板聚集功能。以上研究结果表明我们构建的SRH蛋白保持了各功能域的活性,具有溶栓,抑制血小板聚集和抗凝血酶的功能。二药效学评价,使用apoE-/-小鼠为动物模型,高脂饲料喂养,观察连续静脉注射SRH后其动脉粥样硬化进展情况。结果显示SRH给药组具有抗AS的作用。主动脉窦部HE染色结果显示,模型组主动脉窦部粥样硬化病变非常显著,AS斑块占管腔面积为91%,SRH治疗组:1mg/kg体重组斑块占管腔面积为:39%,0.125mg/kg体重组斑块占管腔面积为:43%。结果显示与模型组相比,治疗组AS斑块病变有明显减轻的趋势。对小鼠CRP检测显示SRH可以显著降低apoE-/-小鼠CRP水平,这一结果提示我们SRH治疗动脉粥样硬化的功能可能通过抗炎性机制实现。三为进一步研究SRH蛋白的抗动脉粥样硬化机制,我们选择血管内皮细胞系HUVEC,检测了SRH蛋白对HUVEC细胞的作用。研究发现SRH蛋白可以抑制凝血酶诱导的动脉粥样硬化相关基因PAI-1,ICAM-1,VCAM-1,IL6,IL8,MCP-1,TF的mRNA表达水平,抑制IL6,MCP-1的分泌,抑制细胞膜粘附分子ICAM-1,VCAM-1的表达,抑制凝血酶诱导的单核细胞与血管内皮细胞的粘附。这些研究结果提示SRH蛋白可以通过抑制凝血酶对内皮细胞的作用发挥其抗炎功能,进一步抑制动脉粥样硬化。四由于SRH蛋白在SAK基础上融合了其它分子,这种变化可能会造成在体内代谢的变化。为了初步检测SRH蛋白在体内的代谢情况并与SAK进行比较,我们制备了SRH的兔源及鼠源多克隆抗体,建立了双抗夹心ELISA方法检测SRH及SAK含量的方法,并使用该方法检测了动物体内SRH蛋白及SAK蛋白的代谢情况,结果显示这两种蛋白在动物体内代谢存在一定的差异,SRH半衰期有延长的趋势,为进一步研究SRH蛋白的药学功能奠定了基础。总之,我们针对AS发生和发展的特点构建了多功能融合蛋白SRH,以实现多靶点治疗AS。在本研究中我们完成了SRH的构建表达和纯化,对各功能域的体外活性检测;在AS动物模型中评价了SRH的对AS治疗作用,并初步探讨了其作用机制;建立了SRH含量检测方法,并在动物体内初步检测了SRH的代谢情况。这些工作为SRH的成药性做了初步评价,也为新型抗AS药物的研制奠定基础。
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