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基于壳聚糖水凝胶的可注射性心肌组织工程研究

作　者: 刘志强
导　师: 王常勇
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 心肌梗死 干细胞 心肌组织工程 壳聚糖基水凝胶 心梗微环境
分类号: R542.22
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


心肌梗死导致心肌细胞大量死亡，进而可能发展为心力衰竭，具有很高的发病率与死亡率，严重威胁人类健康。针对心肌梗死的现有临床治疗手段，如药物治疗，介入治疗，心脏移植等，均存在着一定局限性，不能完全满足心肌梗死治疗的需求。因此，寻找新的、更为有效的心肌梗死治疗方法已成为临床上急需解决的问题之一。近年来，干细胞与组织工程的兴起为心肌梗死的治疗带来了新的机遇。在早期研究中，研究者将单纯的干细胞移植到缺血的心肌，发现心脏功能在一定程度上得到改善。随着研究的深入，人们发现单纯的干细胞移植往往存在着细胞滞留率低、存活率低等问题，对心脏功能的长期改善效果并不理想。研究表明，可注射性心肌组织工程策略有望克服上述问题，近年来受到越来越多的关注，研究进展迅速。种子细胞、可注射性支架材料是可注射性心肌组织工程研究的重要组成要素。在种子细胞研究方面，目前已有多种干细胞类型被用作心肌组织工程，包括多能性、定向能以及全能性的干细胞。然而，关于心肌组织工程理想的种子细胞类型研究者尚未达成共识。骨髓间充质干细胞（BMSC）是心肌组织工程研究最为广泛的多能性干细胞之一，具有潜在的临床应用前景。近年来研究发现，白色脂肪间充质干细胞（ADSC）与BMSC具有相似的性质，具有明显的心梗修复效果，而其来源更为广泛，细胞获取更为简便，在心肌梗死的治疗中具有重要研究价值。心脏干细胞（CSC）是心血管谱系定向能的干细胞，也是心肌组织工程研究的重要种子细胞。传统的CSC来源主要是心肌组织，显然这一来源在研究应用中受到很大的限制。近年来的研究发现，棕色脂肪组织CSC是心脏干细胞的新来源，具有与心脏来源CSC相似的较高心肌分化潜能，在未来心肌再生研究中具有潜在价值。然而，现有的棕色脂肪CSC分离方法效率较低，极大限制了当前的研究，高效分离棕色脂肪CSC方法的建立对于推动棕色脂肪CSC的研究与应用具有重要意义。诱导型多能干细胞（iPSC）是一类与ESC高度相似的新型干细胞，但却避开了ESCs面临的伦理问题。研究已表明，iPSC移植后具有促进心梗修复的治疗潜能。然而，作为一种全能性的干细胞类型，致瘤性以及自身的免疫原性问题，依然是iPSC在心肌组织工程应用中备受关注的问题，尚待进一步阐明。在干细胞治疗研究中，一种可靠的细胞标记方法对于细胞命运追踪与治疗效果的评价至关重要。基于组织学的检测方法无法实现对同一只动物的动态追踪，且检测结果易受取材偏差的影响。基于荧光素酶（Fluc）标记的生物发光成像技术是一种非侵袭性的检测方法，能从整体水平上对活体动物进行连续追踪，且具有定量、实时、灵敏的优点，已广泛应用于干细胞与组织工程研究，对干细胞心梗移植后的命运追踪与治疗效果评价具有重要价值。在支架材料方面，也已有多种可注射性支架材料成功用于心肌组织工程研究，包括天然生物材料与人工合成生物材料。过去的研究中，基于可注射性支架材料心肌组织工程研究取得了一系列进展，发现可注射性支架材料在干细胞移植中可能具有提高细胞滞留与存活、调控干细胞功能发挥等多重作用。然而，以往的研究对可注射性支架材料发挥作用的机制关注甚少。我们以前的研究中，成功将温敏性壳聚糖水凝胶作为ESC移植的载体应用于可注射性心肌组织工程，并证实了其促进移植细胞滞留与存活、改善心梗微环境以及促进心梗修复的效果。然而，壳聚糖水凝胶提高移植细胞存活、改善心梗微环境及促进心梗修复效果的作用机制尚不清楚，且未见到相关报道。结合可注射性心肌组织工程当前的国内外研究进展以及存在的问题，本论文主要从以下三个方面开展相关研究工作：第一部分：心肌组织工程不同种子细胞的分离、培养、标记及生物学特性研究实验一：不同干细胞分离、培养与分化研究。白色脂肪与棕色脂肪分别分离自大鼠腹股沟与肩胛骨处脂肪组织；通过胶原酶与胰酶消化法分离白色脂肪ADSC并进行培养扩增，通过流式细胞术、多向分化等对白色脂肪ADSC进行鉴定；通过摸索胶原酶IV、Dispase II与胰酶的不同组合进行棕色脂肪CSC分离的优化，并通过流式细胞术、成心肌分化对其进行鉴定；利用Feeder培养体系对iPSC进行培养扩增，利用抗坏血酸（Vc）诱导iPSC向心肌细胞分化，并对抗坏血酸的最佳作用浓度进行摸索。通过本部分实验，建立白色脂肪ADSC、棕色脂肪CSC以及iPSC培养、分化等体系。结果表明:(1)0.1%胶原酶IV+0.1%Dispase II+0.05%胰酶消化能够显著提高棕色脂肪CSC的分离效率，从而建立一种基于“Cocktail”消化酶的高效分离棕色脂肪CSC的新方法；(2)抗坏血酸能够显著提高iPSC向心肌细胞的分化。实验二：基于慢病毒颗粒的干细胞标记研究。通过质粒共转染293T细胞构建携带荧光素酶（Fluc）、单体红色荧光蛋白（mRFP）与胸苷激酶（tTK）三报告基因的慢病毒颗粒；利用这一慢病毒颗粒，对ADSC、iPSC进行感染标记，并对不同干细胞感染的最佳复合感染指数（MOI）进行摸索。通过本部分实验，建立了慢病毒颗粒制备体系，并掌握了利用慢病毒颗粒对不同干细胞进行标记的关键技术。结果表明，以MOI为10-15慢病毒浓度感染ADSC效率可达70-80%；以MOI为15-20慢病毒浓度感染iPSC效率可达25-30%。实验三：iPSC致瘤性与免疫原性研究。将未分化的iPSC、诱导分化但未纯化的iPSC来源细胞（iPSC-derivates）及iPSC来源心肌细胞（iPSC-CMs）进行裸鼠皮下移植，通过生物发光成像方法对移植细胞的存活、增殖及畸胎瘤形成规律进行动态追踪；在免疫抑制与免疫活性的心梗小鼠模型中，分别进行心肌内移植iPSC与iPSC-CMs，通过生物发光成像方法对移植细胞的存活、增殖及排斥的规律进行动态追踪，并结合宿主淋巴细胞浸润的检测对iPSC的免疫原性变化规律进行揭示。裸鼠皮下移植结果表明，iPSC分化状态对其致肿瘤性具有显著影响，未分化iPSC具有较高的致瘤性风险；心梗环境下移植研究结果表明，iPSC在心梗环境下移植后，随着在心肌内的分化与发育，其免疫原性增强，从而引起宿主免疫排斥反应的增加。第二部分：可注射性壳聚糖基水凝胶制备、生物学评价及细胞保护相关机制研究实验一：温敏性壳聚糖基水凝胶的制备与生物学评价。首先制备了温敏性的壳聚糖水凝胶，通过与ADSC共培养等对其细胞相容性进行评价；在心梗环境下注射后，通过组织学染色对其组织相容性、降解性与ROS清除作用进行评价。结果表明，壳聚糖基水凝胶具有良好的细胞相容性与组织相容性；在心梗微环境下，壳聚糖基水凝胶具有适当的降解速率，并能够有效清除其中的ROS。实验二：壳聚糖降解产物在模拟ROS环境下促进ADSC黏附与存活的研究。在培养基中添加H2O2模拟ROS环境，在这一模型下对ROS损伤ADSC的作用进行了研究。在此基础上，对壳聚糖降解产物D-Glu与N-AC-Glu清除ROS、保护ADSC的作用机制进行了探讨。结果表明，ROS通过下调ADSC黏附相关蛋白的表达诱导ADSC损伤；D-Glu、N-AC-Glu能够通过ROS的清除，减少环境中ROS对ADSC黏附蛋白的下调作用，促进ADSC黏附与存活，从而发挥对ADSC的保护作用。第三部分：温敏性壳聚糖基水凝胶携带ADSC心梗移植的实验研究心梗大鼠模型随机分成4组，分别注射100μLPBS（PBS组）、100μL壳聚糖水凝胶（Chitosan组）、100μLADSC/PBS（ADSC/PBS组）、100μLADSC/Chitosan（ADSC/Chitosan组）。移植后不同时间点，通过非侵袭性的生物发光成像方法，对ADSC的滞留与存活进行动态追踪；通过组织学与分子生物学手段，对壳聚糖基水凝胶作用机制进行揭示；移植后4w，通过心脏组织学、超声心动图、血流动力学等多种手段，对心梗修复的效果进行了系统评价。结果表明，壳聚糖基水凝胶作为ADSC心梗移植的支架材料，能够显著提高移植细胞在心梗部位的滞留与存活；在作用机制上，壳聚糖基水凝胶主要通过清除环境中的活性氧改善心梗微环境，促进干细胞存活、归巢与治疗功能发挥，从而促进心脏功能修复。综上所述，本研究建立了白色脂肪ADSC、棕色脂肪CSC及iPSC的培养、分化等平台体系，改进了棕色脂肪CSC的分离方法；在此基础上掌握了利用慢病毒标记不同干细胞的关键技术；基于这一标记技术与非侵袭性成像平台，初步揭示了iPSC体内移植后畸胎瘤形成与免疫原性规律；更重要的是，在体外与体内两种模型下证实了壳聚糖基水凝胶作为ADSC心梗移植的支架材料，能够通过清除环境中的活性氧改善心梗微环境，促进干细胞的存活、归巢与治疗功能发挥。本研究开展的不同干细胞分离、培养、标记与生物学特性研究，揭示的壳聚糖基水凝胶改善心梗微环境与促进心梗修复的作用机制，对于心肌组织工程研究中种子细胞选择、支架材料设计以及未来心肌梗死临床治疗具有重要指导意义。

全文目录


缩略词表  7-8
摘要  8-12
ABSTRACT  12-17
前言  17-23
第一部分：心肌组织工程不同种子细胞的分离、培养、标记及生物学特性研究  23-63
  实验一：不同干细胞分离、培养与分化研究  24-40
    1. 材料  24-25
      1.1 主要仪器设备  24-25
      1.2 主要试剂  25
      1.3 其他  25
    2. 方法  25-30
      2.1 溶液的配制  25-26
      2.2 白色脂肪 ADSC 的分离、培养与鉴定  26-27
      2.3 棕色脂肪 CSC 的分离、培养、鉴定及成心肌分化  27-28
      2.4 iPSC 的培养、鉴定及成心肌分化  28-29
      2.5 统计学分析  29-30
    3. 结果  30-38
      3.1 白色脂肪 ADSC 的分离、培养与鉴定  30-31
      3.2 棕色脂肪 CSC 的分离、培养、鉴定及成心肌分化  31-36
      3.3 iPSC 的培养、鉴定及成心肌分化  36-38
    4. 讨论  38-40
  实验二：基于慢病毒颗粒的干细胞标记研究  40-50
    1. 材料  40-41
      1.1 主要仪器设备  40-41
      1.2 主要试剂  41
      1.3 其他  41
    2. 方法  41-43
      2.1 携带 Fluc-mRFP-tTK 的慢病毒颗粒的制备  41-42
      2.2 病毒滴度测定  42
      2.3 干细胞的慢病毒感染标记  42
      2.4 标记干细胞的分选与鉴定  42
      2.5 报告基因表达分析  42-43
      2.6 统计学分析  43
    3. 结果  43-48
      3.1 慢病毒的制备与滴度测定  43
      3.2 白色脂肪 ADSC 的标记与分析  43-44
      3.3 iPSC 的标记与生物学特征鉴定  44-46
      3.4 报告基因在 iPSC 中的表达活性分析  46
      3.5 报告基因在 iPSC 扩增过程中的表达稳定性分析  46-47
      3.6 报告基因在 iPSC 分过过程中的表达稳定性分析  47-48
    4. 讨论  48-50
  实验三：iPSC 致瘤性与免疫原性研究  50-63
    1. 材料  50-51
      1.1 主要设备  50-51
      1.2 主要试剂  51
      1.3 其他  51
    2. 方法  51-53
      2.1 iPSC 源心肌细胞的诱导分化与分选  51-52
      2.2 iPSC 及其来源细胞的裸鼠皮下移植  52
      2.3 小鼠心梗模型的制备与 iPSC 的心肌内移植  52
      2.4 生物发光成像  52
      2.5 RT-PCR  52-53
      2.6 免疫组织化学染色  53
      2.7 统计学分析  53
    3. 结果  53-60
      3.1 iPSC 诱导分化过程中多能性细胞的存在  53-55
      3.2 iPSC 分化细胞的比较  55
      3.3 裸鼠皮下移植后的生物发光成像  55-56
      3.4 iPSC 及其不同分化产物在裸鼠皮下的致瘤性  56-57
      3.5 心梗小鼠心肌内移植后的生物发光成像  57-58
      3.6 iPSC 心肌内移植后的迁移  58
      3.7 iPSC 在心梗环境下的致瘤性  58-59
      3.8 细胞移植后的免疫细胞浸润检测  59-60
    4. 讨论  60-63
第二部分：可注射性壳聚糖基水凝胶制备、生物学评价及细胞保护相关机制研究  63-78
  实验一：温敏性壳聚糖基水凝胶的制备与生物学评价  64-70
    1. 材料  64-65
      1.1 主要仪器设备  64
      1.2 主要试剂  64-65
      1.3 其他  65
    2. 方法  65-66
      2.1 溶液配制  65
      2.2 温敏性壳聚糖基水凝胶的制备  65
      2.3 大鼠白色脂肪 ADSC 的分离培养  65
      2.4 温敏性壳聚糖基水凝胶与 ADSC 相容性评价  65
      2.5 大鼠心梗模型制备  65-66
      2.6 温敏性壳聚糖基水凝胶的心肌内注射与评价  66
      2.7 心脏标本的 DHE 染色  66
    3. 结果  66-69
      3.1 温敏性壳聚糖水凝胶的制备  66-67
      3.2 温敏性壳聚糖基水凝胶与 ADSC 的生物相容性  67
      3.3 大鼠心梗模型制备  67-68
      3.4 温敏性壳聚糖基水凝胶在心梗环境下的组织相容性检测  68
      3.5 温敏性壳聚糖基水凝胶在心梗环境下的抗氧化能力检测  68-69
    4. 讨论  69-70
  实验二：壳聚糖降解产物在模拟 ROS 环境下促进 ADSC 黏附与存活研究  70-78
    1. 材料  70-71
      1.1 主要仪器设备  70
      1.2 主要试剂  70-71
      1.3 其他  71
    2. 方法  71-73
      2.1 溶液配制  71
      2.2 ROS 对 ADSC 黏附与存活的影响  71
      2.3 ROS 环境下，D-Glu 与 N-AC-Glu 作用浓度摸索  71-72
      2.4 细胞内 ROS 水平检测  72
      2.5 ROS 条件下 D-Glu 与 N-AC-Glu 促 ADSC 黏附分析  72
      2.6 RT-PCR  72
      2.7 蛋白提取与 Western Blotting 检测  72-73
      2.8 统计学分析  73
    3. 结果  73-76
      3.1 ROS 对 ADSC 黏附的影响  73
      3.2 ROS 环境下，D-Glu 与 N-AC-Glu 促进 ADSC 粘附的作用  73-75
      3.4 ROS 对 ADSC 的损伤及 D-Glu/N-AC-Glu 保护作用的相关机制  75-76
    4. 讨论  76-78
第三部分：温敏性壳聚糖水凝胶携带 ADSC 心梗移植的实验研究  78-92
  1. 材料  78-79
    1.1 主要仪器设备  78-79
    1.2 主要试剂  79
    1.3 其他  79
  2. 方法  79-83
    2.1 溶液配制  79-80
    2.2 心梗模型制备与 ADSC 的移植  80
    2.3 生物发光成像分析  80
    2.4 TUNEL 染色  80-81
    2.5 DHE 与 Western Blotting 检测  81
    2.6 超声心动图检测  81
    2.7 血流动力学检测  81
    2.8 心梗面积与室壁厚度计算  81-82
    2.9 血管密度计算  82
    2.10 免疫荧光染色分析  82-83
    2.11 统计学分析  83
  3. 结果  83-90
    3.1 生物发光成像分析  83-84
    3.2 壳聚糖水凝胶对心梗微环境的改善作用及心脏干细胞归巢  84-85
    3.3 心肌梗死后的细胞凋亡  85-86
    3.4 心脏功能  86-88
    3.5 心梗面积与室壁厚度  88-89
    3.6 血管密度  89
    3.7 白色脂肪 ADSC 在心梗环境下的分化  89-90
  4. 讨论  90-92
结论  92-93
未来工作展望  93-94
参考文献  94-100
文献综述  100-119
  Reference  111-119
代表性论著  119-133
个人简历  133-134
致谢  134

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 心脏疾病 > 心肌疾病 > 心肌梗塞
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