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鼠疫菌重要调控蛋白的表达纯化及其DNA结合活性分析

作　者: 罗张
导　师: 周冬生
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 军事预防医学
关键词: 融合蛋白 DNA 表达纯化鼠疫菌凝胶阻滞实验活性分析转录调控序列调控子重组质粒 DNase EMSA 重组蛋白大肠杆菌结合位点异源表达分子克隆技术引物生物信息学 proteins
分类号: R516.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

鼠疫是一种自然疫源性疾病,鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)是其病原菌。鼠疫菌在蚤体和宿主动物之间循环的过程中,受到多种刺激因素(如pH、渗透压、过氧化物、温度等)的刺激,鼠疫菌能感应这种刺激并做出应答,最终使鼠疫菌得以存活并对宿主致病。鼠疫菌对宿主致病的过程,就是其在宿主体内大量繁殖并对宿主产生毒力的过程,从分子水平上看,这是一个有复杂细胞途径构成的紧密调控的过程。其中,鼠疫菌内存在的各种调控子(如PhoP、RovA、H-NS、Fis、CRP等)感应刺激信号,在转录水平上对靶基因的上调和下调,起着关键的作用。目的:本实验利用大肠杆菌BL21λDE3的表达系统,异源表达8个与鼠疫菌传播及致病密切相关的调控子蛋白:PhoP、OxyR、RcsB、RovA、H-NS、CRP、Fur和OmpR。并对这些蛋白与DNA的结合活性进行分析,为构建鼠疫菌毒力基因转录调控网络建立分子生化实验平台。方法:利用生物学软件设计鼠疫菌调控子蛋白基因phoP、oxyR、rcsB、rovA、hns、crp、fur、ompR的ORF区的上下游引物,并PCR扩增,纯化后通过酶切连接等分子克隆技术,分别将它们的ORF区直接克隆入pET28a质粒中,而后再将重组质粒转入大肠杆菌BL21菌株中,通过筛选鉴定构建出鼠疫菌调控子蛋白的表达菌株;所得菌株经IPTG诱导后能分别表达带His标签的鼠疫菌PhoP、OxyR、RcsB、RovA、H-NS、CRP、Fur和OmpR融合蛋白,利用Ni-NTA柱结合融合蛋白,经洗涤、洗脱、浓缩等步骤进一步纯化这些融合蛋白。利用生物信息学方法,对上述调控子蛋白与DNA的结合序列进行预测,筛选可能的靶基因,并通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)验证上述蛋白与靶DNA的结合活性。EMSA实验是利用核酸与蛋白结合后,分子量变大,在其它条件一致的情况下,电泳迁移率变慢的原理来验证蛋白是否与特定核酸结合。挑选H-NS重组蛋白,利用Dnase I足迹实验,研究其对靶基因结合位点的特点,分析结合序列的GC含量,进一步验证所表达蛋白的正确性。DNaseⅠ足迹实验的原理是利用DNaseⅠ随机消化DNA序列,而被蛋白结合的序列免于消化,从而在聚丙烯酰胺凝胶上出现空白区域(即“足迹”),如若配伍测序带就能直接读出空白区域所对应的碱基序列。结果:成功的表达出有活性的鼠疫菌PhoP、OxyR、RcsB、RovA、H-NS、CRP、Fur和OmpR调控子融合蛋白,这些蛋白与靶基因启动子区具有体外结合活性。EMSA结果表明:PhoP、OxyR、RcsB、RovA、CRP、Fur和OmpR能分别特异性结合到YPO0736,hmsT、waaA、psaE、ompC、yfeA和ompF的启动子区,不仅说明所表达的融合蛋白是有活性的,也反映出鼠疫菌上述调控子对其能结合的靶基因具有直接的调控作用。对于H-NS蛋白,选择了pla和pst这2个靶基因去研究,EMSA结果表明H-NS能直接作用于这两个基因的启动子区,表示H-NS能直接调控它们的表达;而DNaseⅠ足迹实验结果更进一步证实了这个结果。对H-NS结合位点的碱基GC含量分析发现,被结合的位置都是低GC(含量不足30%)含量的位置,这和H-NS对高AT含量的DNA序列具有结合偏好的特点相符合,说明所表达纯化的H-NS融合蛋白是完全正确,且是有活性的。结论:成功表达了鼠疫菌的8种调控子融合蛋白,即PhoP、OxyR、RcsB、RovA、H-NS、CRP、Fur和OmpR,它们分别对YPO0736,hmsT,waaA,psaE,pla(还有pst),ompC,yfeA和ompF具有良好的结合作用;H-NS对靶基因pla和pst的结合序列的碱基组成特点和理论一致,进一步说明利用大肠杆菌所表达的H-NS融合蛋白是完全成功的。意义:通过本课题的研究,构建出8个有活性的鼠疫菌关键调控子蛋白,这是转录调控研究时体外实验的基础;而EMSA和DNaseⅠ足迹实验平台的建立与完善,也为后续的鼠疫菌转录调控研究奠定了一定的基础;有了上述2个基础,就为鼠疫菌毒力基因转录调控网络的构建打下了一个坚实的基础,对鼠疫的治疗以及疫苗抗原蛋白的筛选都有一定的意义。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
缩略语  9-10
前言  10-21
  1. 鼠疫耶尔森氏菌  10-12
    1.1 微生物学特征  10
    1.2 鼠疫菌的流行病特征  10-11
    1.3 鼠疫菌致病机制  11-12
  2. 鼠疫菌重要的毒力调控因子  12-20
    2.1 二元调控系统PhoP-PhoQ  12-13
    2.2 毒力调控子RovA  13-14
    2.3 热稳定性拟核结构蛋白H-NS  14-15
    2.4 cAMP 受体蛋白-CRP  15-16
    2.5 过氧化物感应调节子OxyR  16-17
    2.6 二元调控系统-Rcs 系统  17-18
    2.7 鼠疫菌调控因子Fur  18-19
    2.8 二元调控系统EnvZ/OmpR  19-20
  3. 本研究的目的和意义  20-21
材料与方法  21-37
  1. 材料  21-26
    1.1 菌株与质粒  21
    1.2 酶，试剂盒  21
    1.3 药品，试剂，溶液的配制  21-26
    1.4 主要仪器  26
  2. 方法  26-37
    2.1 鼠疫菌201 株基因组DNA 的提取  26
    2.2 鼠疫菌重要调控子蛋白的克隆表达  26-31
    2.3 目的蛋白DNA 结合活性分析  31-37
结果与讨论  37-50
  1. 本文所涉及调控子蛋白的信息分析  37
  2. 调控子蛋白的表达与纯化  37-41
  3. 调控子蛋白与DNA 结合活性分析  41-50
    3.1 各蛋白与靶DNA 结合基序的生物信息学分析  41-43
    3.2 调控子蛋白与靶基因的EMSA 实验结果  43-47
    3.3 DNase Ⅰ足迹实验结果  47-50
结语  50-52
参考文献  52-57
综述  57-64
  参考文献  61-64
个人简历  64-65
致谢  65

鼠疫菌重要调控蛋白的表达纯化及其DNA结合活性分析

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