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抗乙型肝炎病毒潜在药物靶标的筛选和验证

作　者: 吴小桃
导　师: 王升启; 杨静
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 乙型肝炎病毒(HBV) 反义脱氧寡核苷酸(ASODN) HepG2.2.15
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:乙型肝炎病毒(HBV)感染是个全球性问题,我国是公认的乙型肝炎病毒(HBV)感染高流行区。随着对乙型肝炎病毒的结构及功能研究的深入,以病毒为靶点的药物研究逐渐引起人们的重视。为此我们比对了HBV各个亚型,选择了其保守区,利用生物信息学的软件设计了批反义寡核苷酸,对其抗HBV活性进行了筛选并对其靶位点进行了优化,目的在于找到新的病毒作用靶标。但是由于HBV基因组较小,易发生突变,限制了靶向病毒的抗病毒药物的发展。与病毒基因组相比,人类基因组序列中可能包括更多与病毒复制有关的基因,抑制这些基因的功能可能阻断病毒感染。些研究结果也证明抑制这些与HBV复制相关的宿主基因的表达可阻断HBV病毒的感染。本研究利用反义寡核苷酸技术筛选和验证病毒及宿主细胞内潜在的抗HBV药物作用靶标,为新型抗病毒药物的筛选奠定基础。方法:本实验通过生物信息学分析设计了批针对HBV RNA的反义寡核苷酸,同时基于生物信息学的预测,结合病毒宿主相互作用网络,构建了个HBV复制相关基因网络,并根据GeneBank中的各基因核酸序列mRNA,利用Antisense design对这些基因进行基于多预测RNA二级结构的计算机辅助设计,通过与GeneBank联机blast序列比对获得了理论上靶向上述基因的反义寡核苷酸各5条,在HepG2.2.15细胞模型上通过ELISA,RT-PCR、Western印迹技术筛选及验证对HBV复制的影响。结果:通过在HepG2.2.15细胞模型上的抗HBV反义寡核苷酸的筛选,从病毒靶向的30多条反义序列中筛选出了3条具有抗HBV活性的反义寡核苷酸,同时从40多个与HBV复制相关的基因中筛选出了2个潜在的抗HBV药物作用靶标。病毒靶向的反义寡核苷酸活性筛选结果显示:序列self1820、self1852和self2057对HepG2.2.15细胞上清中的HBsAg和HBeAg有明显的抑制作用,且细胞毒性检测实验显示反义序列self1820、self1852和self2057在给药浓度为0.2μM-6.4μM范围内不影响HepG2.2.15细胞增殖。宿主靶标的活性筛选结果发现:分别靶向COX6A1(细胞色素c氧化酶亚基VI a肽1 cytochrome c oxidase subunit Via polypeptide 1)[2]和PPARα(过氧化物酶体增殖活化受体α, peroxisome proliferative activated receptor, alpha)的反义寡核苷酸序列COX6A1-2和PPARα-2能显著抑制HepG2.2.15细胞上清中的HBsAg和HBeAg的分泌,并呈现良好的剂量依赖关系。同时COX6A1-2和PPARα-2还可特异性并剂量依赖的抑制HepG2.2.15细胞中COX6A1和PPARαmRNA及蛋白的表达。上述研究结果初步确定了COX6A1和PPARα可能成为抗HBV新型作用靶点。结论:通过实验发现靶向HBV自身的反义序列self1820、self1852和self2057具有良好的抗HBV活性,同时本研究通过筛选和初步验证确定了COX6A1和PPARα可能成为抗HBV新型作用靶点。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
前言  11-15
实验材料  15-19
第一部分靶向HBV RNA 的反义寡核苷酸的可药性验证  19-27
  一、方法  19-20
  二、结果  20-26
  三、讨论  26-27
第二部分抗HBV 潜在药物宿主靶标的筛选与验证  27-49
  第一节靶向宿主编码基因的反义寡核苷酸抗 HBV 活性的初步筛选  27-33
    一、方法  27-28
    二、结果  28-31
    三、讨论  31-33
  第二节抑制 COX6A1 表达的反义寡核苷酸可阻断 HBV 的复制  33-41
    一、方法  33-36
    二、结果  36-40
    三、讨论  40-41
  第三节抑制 PPARΑ表达的反义寡核苷酸可阻断 HBV 的复制  41-49
    一、方法  41-42
    二、结果  42-47
    三、讨论  47-49
第三部分全文总结  49-51
参考文献  51-55
文献综述  55-65
   参考文献  63-65
附录  65-73
个人简历  73-75
致谢  75

抗乙型肝炎病毒潜在药物靶标的筛选和验证

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