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基于氧化石墨烯和纳米金的高灵敏度免疫检测新方法研究

作　者: 林虹君
导　师: 钱小红; 张养军
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析学
关键词: 纳米金氧化石墨烯 western blotting ELISA
分类号: R446.6
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

蛋白质组学研究的核心技术是规模化发现和高通量验证,目前依赖于质谱技术的规模化发现技术已获得到较快的发展,但是藉此确定的目标蛋白质的准确验证仍然是一个具有挑战性的课题。现有的验证方法主要是基于质谱的多反应监测质谱方法(multiple reaction monitoring, MRM)和基于抗体的免疫检测方法。MRM方法虽然具有较好的规模化能力,但是其灵敏度较低,因而其应用受到限制,所以免疫检测方法仍是目前首选的方法。免疫检测方法的灵敏度相对较高,但是该方法需要依赖昂贵的抗体,且对于低丰度蛋白质,其灵敏度仍不能满足要求,迫切需要新的灵敏度高、价格低廉的免疫检测方法。针对以上问题,本研究将纳米金(GNP)和氧化石墨烯(GO)引入到目前常用的免疫检测方法,即蛋白质免疫印迹(western blotting)和酶联免疫吸附实验法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)中,发展了新的免疫检测方法。其主要原理是基于这两种纳米载体拥有大的比表面积,可以逐级放大检测信号,同时双一抗的引入和增大辣根过氧化物酶(HRP)与二抗的比例等,在提高灵敏度的同时,大大降低了成本。基于以上原理,发展了新的免疫检测方法,包括：基于氧化石墨烯和纳米金的信号双重放大western blotting新方法和基于氧化石墨烯和纳米金的信号三重放大ELISA新方法。在基于氧化石墨烯和纳米金的信号双重放大western blotting新方法的研究中,同时引入了纳米金和氧化石墨烯。首先用纳米金与一抗结合,使得一定量的抗原能够间接地与更多的一抗相结合,扩大了一抗与抗原的比例。然后用氧化石墨烯与二抗结合,使得一定量的一抗能够结合更多的二抗,增大了二抗与一抗的比例。通过两次比例的扩增,信号得到逐级放大,检测限被大大降低。而在纳米金与一抗结合过程中,同时引入两种一抗(与抗原对应的特异性一抗和辅助一抗),由于辅助一抗在价格上比特异性一抗更低廉,所以通过该步骤操作,在放大信号的同时,使昂贵的特异性一抗成本大大降低。western blotting新方法的优点是在检测信号进行双重放大的同时使得成本大大降低,拓宽了传统western blotting方法的应用范围,增强了检测能力。实验结果表明,改进后的western blotting和传统Western blotting方法对GST蛋白质的检测限分别为2ng mL-1和64ng mL-1,新方法的检测限降低了32倍,成本也大大降低。而且多次重复实验结果表明,该方法稳定性好。在基于氧化石墨烯和纳米金的信号三重放大ELISA新方法的研究中,分三次先后引入了纳米金、氧化石墨烯和纳米金。首先将纳米金与双一抗按一定比例结合,通过此步操作,实现信号的第一次放大和成本的第一次降低；其次,通过纳米金与二抗和高比例的HRP结合(此处加入的HRP与二抗的比例是100：1),实现信号的第二次放大和成本的第二次降低。最后,将氧化石墨烯与第二步中制备的中间体结合,扩大了二抗与一抗的结合比例,达到了再次放大信号的目的。这种依次将纳米金、氧化石墨烯和纳米金引入传统ELISA中建立的新ELISA方法,本文称之为3G-ELISA。与传统的ELISA方法相比,3G-ELISA方法对信号进行了三次放大,并两次降低成本。实验结果表明,3G-ELISA方法能对血清中的HSP70抗原进行灵敏检测,与传统ELISA方法相比,检测限降低了64倍,成本降低为原来的十分之一。而且该方法稳定性好,可用于诊断标记物和药物靶标等低丰度蛋白质的验证和临床检测。

全文目录

目录  5-7
缩略语索引  7-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章前言  12-29
  1 蛋白质免疫印迹法  12-17
    1.1 基本原理  12
    1.2 操作步骤  12-14
    1.3 分类和特点  14
    1.4 方法研究进展  14-17
  2 酶联免疫吸附检测  17-27
    2.1 基本原理  17-18
    2.2 操作步骤  18
    2.3 分类和特点  18-23
    2.4 方法研究进展  23-27
  3 本文立题依据  27-28
    3.1 本论文研究背景  27
    3.2 主要研究内容  27-28
  参考文献  28-29
第二章基于氧化石墨烯和纳米金的信号双重放大蛋白质免疫印迹新方法研究  29-40
  1 材料与方法  29-31
    1.1 主要试剂  29
    1.2 仪器设备  29-30
    1.3 实验方法  30-31
      1.3.1 GNP和GNP-Ab1的制备  30
      1.3.2 GNP和GNP- Ab1的表征  30
      1.3.3 GO-Ab2结合体的制备  30-31
      1.3.4 样本的制备  31
  2 结果与讨论  31-36
    2.1 抗体需用量考察  31-32
    2.2 双一抗最佳比例考察  32-33
    2.3 GO和GO-Ab2结合体的表征  33-34
    2.4 Western blotting新方法建立  34-35
    2.5 新方法性能考察  35-36
    2.6 新方法在实际样本检测中的应用  36
  3 小结  36-38
  参考文献  38-40
第三章基于氧化石墨烯和纳米金的信号三重放大酶联免疫吸附检测新方法研究  40-50
  1 材料与方法  40-43
    1.1 主要试剂  40-41
    1.2 仪器设备  41
    1.3 实验方法  41-43
      1.3.1 GNP和GNP-Ab1的制备  41
      1.3.2 GO-Ab2结合体的制备  41
      1.3.3 GO-Ab2-GNP-HRP结合体的制备  41-42
      1.3.4 3G-ELISA新方法建立  42-43
  2 结果与讨论  43-46
    2.1 3G-ELISA方法原理  43
    2.2 3G-ELISA新方法性能考察  43-45
    2.3 3G-ELISA新方法用于实际样本的检测  45-46
  3 小结  46-47
  参考文献  47-50
全文小结  50-51
个人简历  51-52
在读期间研究成果  52-53
致谢  53-54
代表性论著  54-62

基于氧化石墨烯和纳米金的高灵敏度免疫检测新方法研究

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