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重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白临床新靶点研究

作　者: 刘巍
导　师: 范开
学　校: 重庆理工大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）纤维蛋白原（FIB）抗凝血酶III（AT-III）纤维蛋白溶酶原（PLG）
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（简称TNHH）在白细胞抑制因子（NIF）和水蛭肽（Hirulog）中间加入了一段交联肽，能与血凝块中纤维蛋白结合的导向性，实现了降低NIF和Hirulog片段的风险性，增加有效性的目的，能有效抑制白细胞活化、迁移、粘附功能，抑制凝血酶活性、血细胞与纤维蛋白结合。本品在急性缺血性脑卒中动物模型中具有多重功效，能有效促进脑组织损伤修复和保护，改善局部抗凝微循环和血流再灌注，抑制凝血酶引起的脑水肿，促进脑血肿的吸收。目的：探讨重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白临床新靶点。方法：取健康人的纤维蛋白原（FIB）、抗凝血酶II（IAT-III）和纤维蛋白溶酶原（PLG）分别与TNHH进行体外结合实验，具体采用免疫印迹鉴别实验及分别结合HPLC分析，抗凝血酶III（AT-III）活性分析，D-二聚体转化实验中的D-二聚体含量测定分析判定。在上述实验判定靶点基础上，利用CADD（计算机辅助药物设计）与可能的新靶点纤维蛋白原（FIB），抗凝血酶II（IAT-III）和纤维蛋白溶酶原（PLG）进行分子对接（DOCK），采用PSIPRED2.4，Sybyl8.0和Discovery Studio2.5软件进行靶点验证结果。结果：重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH)分别与纤维蛋白原（FIB），抗凝血酶III（AT-III）和纤维蛋白溶酶原（PLG）进行免疫印迹鉴别实验，兔抗TNHH多抗与TNHH+FIB和TNHH+AT-III实验组的免疫印迹结果呈阴性，而与TNHH+PLG实验组的免疫印迹结果呈阳性。鼠抗纤维蛋白原（FIB）单抗，鼠抗凝血酶III（AT-III）单抗分别与TNHH+FIB和TNHH+AT-III实验组的免疫印迹结果呈阴性，而鼠抗维蛋白溶酶原（PLG）单抗和TNHH+PLG的免疫印迹结果呈阳性。这说明TNHH中不含有纤维蛋白原（FIB）或抗凝血酶III（AT-III），而TNHH中含有维蛋白溶酶原（PLG），表示TNHH与FIB或AT-III无结合，而与PLG有结合。将纤维蛋白原（FIB）与TNHH进行体外结合实验的HPLC分析，结果显示：标准对照TNHH的保留时间为16.335min，峰面积为33578168.000；阳性对照TNHH+兔抗TNHH多抗中TNHH的保留时间为16.095min，峰面积为13985716.804；实验组TNHH的保留时间为15.655min，峰面积为34964292.010；这表明标准对照中的TNHH和实验组中的TNHH峰面积并没有太大差异，表明FIB与TNHH无结合。将抗凝血酶III（AT-III）与TNHH进行体外结合实验的AT-III：A活性分析，结果显示：标准对照AT-III的活性为104.7%，阳性对照AT-III的活性为48%，实验组AT-III的活性为109.3%，这表明标准对照AT-III和实验组AT-III的活性二者之间并没有显著的差异，说明抗AT-III与TNHH无结合，不能抑制抗凝血酶III的活性。将纤维蛋白溶酶原（PLG）与TNHH进行体外结合实验的D-二聚体转化实验分析，结果显示：阳性对照有D-二聚体生成，并且含量为0.246mg/L。实验组有D-二聚体生成，并且含量为0.068mg/L。这说明纤维蛋白溶酶原（PLG）与TNHH有结合，产生纤维蛋白溶酶，纤维蛋白溶酶催化纤维蛋白降解生成D-二聚体。通过计算机辅助药物设计（CADD）的PSIPRED，Sybyl8.0和Discovery Studio2.5软件分析，纤维蛋白溶酶原（PLG）C端的第153位Arg至175位的Tyr为一段保守序列RNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDY与重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）的C端的第133位Lys至140位的Tyr为一段保守序列KEGEGVLY在蛋白质的空间结构中存在相互作用，而纤维蛋白原（FIB）和抗凝血酶III(AT-III)均没有功能核心区域与TNHH之间有相互作用。结论：通过免疫印迹鉴别实验，HPLC实验，AT-III：A活性实验和D-二聚体转化实验分析，以及结合PSIPRED，Sybyl8.0和Discovery Studio软件进行靶点验证分析。可以初步得出结论是：TNHH临床新靶点为纤维蛋白溶酶原（PLG）。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-11
1. 引言  11-33
  1.1 急性脑卒中病理机理  12-14
  1.2 TNHH 的临床研究资料  14-15
  1.3 TNHH 与 UK-279.276 的比较  15-20
  1.4 TNHH 与 Hirulog 的比较  20-21
  1.5 CD11b/CD18 的生物作用和 NIF 介绍  21
  1.6 凝血酶的阴离子结合区的生物作用和 Hirulog 介绍  21-22
  1.7 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）的创新性  22-25
    1.7.1 TNHH 的设计思路  22-23
    1.7.2 TNHH 双靶点设计的思路  23
    1.7.3 TNHH 的结构组成及创新性  23
    1.7.4 TNHH 的可行性  23-24
    1.7.5 嵌合表达的目的  24-25
  1.8 TNHH 双靶点功能特点与验证  25-28
    1.8.1 TNHH 双靶点功能特点  25-27
    1.8.2 TNHH 双靶点验证  27-28
  1.9 TNHH 临床新靶点研究对象依据  28-31
  1.10 TNHH 临床新靶点研究技术路线  31-33
2. TNHH 临床新靶点研究实验方法  33-49
  2.1 取健康人的纤维蛋白原（FIB）与 TNHH 进行体外结合实验  33-37
    2.1.1 TNHH 与 FIB 的免疫印迹鉴别实验  33-36
    2.1.2 TNHH 与 FIB 的高效液相色谱法（HPLC 外标法）  36-37
  2.2 取健康人的抗凝血酶 III（AT-III）与 TNHH 进行体外结合实验  37-42
    2.2.1 TNHH 与 AT-III 的免疫印迹鉴别实验  37-40
    2.2.2 TNHH 与 AT-III 的抗凝血酶 III:A 活性检测（发色底物显色法）  40-42
  2.3 取健康人的纤维蛋白溶酶原（PLG）与 TNHH 进行体外结合实验  42-47
    2.3.1 TNHH 与 PLG 的免疫印迹鉴别实验  42-45
    2.3.2 TNHH 与 PLG 的 D-二聚体转化实验（ELISA 法）  45-47
  2.4 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）的 CADD 靶点验证  47-49
    2.4.1 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）分别与 FIB，AT-III 和 PLG 进行分子对接（DOCK）实验  47-49
3. TNHH 临床新靶点研究实验结果与实验讨论  49-69
  3.1 取健康人的纤维蛋白原（FIB）与 TNHH 进行体外结合实验结果  49-52
    3.1.1 TNHH 与 FIB 免疫印迹鉴别实验结果  49-50
    3.1.2 TNHH 与 FIB 的分子筛 HPLC 外标法分析结果  50-51
    3.1.3 实验讨论  51-52
  3.2 取健康人的抗凝血酶 III 与 TNHH 进行体外结合实验结果  52-55
    3.2.1 TNHH 与 AT-III 免疫印迹鉴别实验结果  52-53
    3.2.2 TNHH 与 AT-III 的 AT-III：A 活性分析结果  53-54
    3.2.3 实验讨论  54-55
  3.3 取健康人的纤溶酶原（PLG）与 TNHH 进行体外结合实验结果  55-58
    3.3.1 TNHH 与 PLG 免疫印迹鉴别实验结果  55-56
    3.3.2 TNHH 与 PLG 的 D-二聚体转换实验结果  56-57
    3.3.3 实验讨论  57-58
  3.4 重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白（TNHH）的靶点验证结果  58-69
    3.4.1 TNHH 与 FIB、AT-III 和 PLG 的 CADD 靶点验证实验结果  58-67
    3.4.2 实验讨论  67-69
4. 全文讨论与结论  69-79
  4.1 讨论  69-78
    4.1.1 展望  77
    4.1.2 不足之处  77-78
  4.2 结论  78-79
致谢  79-81
参考文献  81-85
附录英文缩写索引  85-87
个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果  87

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白临床新靶点研究

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