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建立SILAC定量技术并发现CD40受体激活后招募的复合物新组分

作　者: 桑志红
导　师: 张学敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: 细胞培养中氨基酸稳定同位素标记方法 CD40 质谱定量蛋白质组
分类号: R392.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

细胞内蛋白质相互作用的研究是目前生命科学研究的热点领域，这些研究有助于我们了解蛋白质功能，以及阐明信号通路转导过程，进而揭示生命的奥秘。随着科学技术的进步，我们目前拥有了不少研究蛋白质相互作用的技术方法，但是面对如此复杂而又精密的生命体系，这些技术所能解决的问题还很局限，其中如何研究蛋白质动态的相互作用就是核心问题之一。同静态的相互作用相比，蛋白质之间的解离、聚合、再解离、再聚合，更吸引着生物学家的目光，因为这往往意味着某条信号通路的激活或抑制，而这些信号通路通常又是引起细胞生长、分化、突变、衰老、死亡等复杂生理或病理变化的始动因素。肿瘤坏死因子受体超家族中的许多成员在免疫反应中起着至关重要的作用，其中CD40是I型由免疫系统的抗原呈递细胞表达的膜蛋白，是由激活的T细胞表达的细胞表面蛋白CD154的受体，它是MAPK、NFκB通路及非经典NFκB通路的重要激活子。其介导的信号通路不仅对免疫应答至关重要，而且与自身免疫性疾病，神经退行性疾病等密切相关。因此，深入理解CD40信号通路的分子机制以逐渐成为目前研究的热点之一。目前的研究揭示CD40受体激活的过程显示：CD40首先招募直接与其相互作用的TNF受体相关因子TRAFs（TNF receptor associate factor），并由TRAFs作为adaptor招募下游信号激活关键分子如NFκB和应激激活蛋白激酶等，形成受体复合体；再通过受体复合体中的部分分子激活下游信号转导通路，以实现其生物学效应。但是，CD40在抗原呈递细胞中的传导激活信号机制并不是完全清楚，因此，研究CD40信号复合体的组成及功能将有助于阐明CD40引起的信号转导通路的分子机制，而CD40信号激活状态下的动态蛋白质复合物组成也将成为CD40信号通路研究的前沿本研究利用最新蛋白质组学定量技术，研究细胞表面受体CD40激活后细胞内的蛋白质相互作用，初步建立一套可用来分析蛋白质动态相互作用的技术体系，并在CD40信号激活过程中，研究寻找CD40受体复合物的动态新组成。蛋白质复合物的研究方法主要包括酵母双杂交、蛋白芯片，串联亲和纯化结合质谱法以及基于生物信息学的分析等。近年来，基于质谱的定量蛋白质组学技术发展日新月异，又为生物学家研究蛋白质相互作用提供了一种新的技术手段。基于质谱的定量蛋白质组学技术应用于相互作用的研究原理是用亲和纯化的方式富集对照和实验组蛋白复合体，其中，背景蛋白和非特异结合是等量存在的，当实验组信号通路激活时，实验组结合的特异蛋白质的量与对照组相比会发生变化（上调或者下调）。从而可以排除背景和非特异结合蛋白，识别与信号转导通路相关的特异性结合蛋白。这种基于质谱的定量蛋白质组学技术主要包括稳定同位素标记和非标记的定量分析方法，其中，基于稳定同位素标记的方法常用的又分为两类：一类是体外化学标记的蛋白质组定量分析，包括同量异构标记的相对和绝对蛋白定量技术（Isobaric Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation, iTRAQ）和同位素亲和标签（Isotope-Coded Affinity Tagging ,ICAT）等，另一类是稳定同位素代谢标记的蛋白质定量分析方法，如细胞培养中氨基酸稳定同位素标记方法（StableIsotope Labeling of Amino acids in Cell Culture,SILAC）。SILAC技术由于标记效率高、重复性好、变异系数小和定量结果准确度高等特点成为一种分析动态相互作用结合蛋白的最有效的方法。其基本原理是分别利用天然和重型稳定同位素标记的氨基酸培养细胞，对细胞分别进行培养，经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中。轻、重稳定同位素标记的细胞，按细胞数或蛋白量等比例混合后，按蛋白质组学方法制样后，用质谱进行定性和定量分析。SILAC技术用于解析蛋白质相互作用，可以克服传统研究方法（如酵母双杂交、蛋白芯片等）的局限，它可以研究内源性蛋白质相互作用，能有效区别背景与真实的相互作用蛋白质，找出动态结合蛋白质，检测弱的或不稳定的相互作用蛋白质，并能大规模的实时分析蛋白相互作用的动态变化。本研究根据配体激活CD40激活点实验，选择研究CD40配体刺激10分钟的动态相互作用蛋白，实验选用了传统的SILAC实验步骤即PAM（Purification afterMixing）和改进的SILAC实验步骤MAP（Mixing after Purification）来完成实验，在三次试验中共鉴定出2130个蛋白质，其中310个经软件分析得到定量信息，234个蛋白质在三次实验中均被鉴定出来。配基刺激A20细胞10分钟后上调蛋白质（RATIO>1.3%）51个，下调蛋白质（RATIO<0.7%）14个，在鉴定的蛋白中找到了一些可能参与CD40信号通路的蛋白，其中与泛素蛋白酶体通路相关的有OTUB1、NEDD4，UBR2等；与通路相关的激酶，如MAPKK3和Dual specificitytyrosine phosphorylation regulated kinase 1；与NFκB信号通路相关的蛋白有NFκBp100，NFκB activator 1，Myb binding protein 1，Sequestosome 1等，还有一些具有其他重要功能蛋白有NEDD1，ADPATPtransfor 1，Non POU domaincontaining octamer binding protein等，现在我们正在对上述蛋白进行进一步验证以及功能探索，通过Westen blot我们已经验证了NEDD4与CD40的相互作用，为CD40信号通路的调控及其机制的研究提供了十分重要的线索。本研究建立了用SILAC定量技术体系研究细胞内CD40激活后蛋白质相互作用的动态变化。不仅为CD40信号通路的研究提供了重要的线索，更为重要的是我们初步搭建了一个研究蛋白质复合物动态变化的技术平台，为其它重要信号通路的研究提供了一个可选的技术手段。

全文目录

缩略词索引表  6-7
摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-18
材料与方法  18-28
  1. 材料及来源  18-19
    1.1. 试剂  18
    1.2. 主要仪器设备  18-19
  2. 实验方法  19-28
    2.1. SILAC 标记操作流程  19-20
      2.1.1. 等量混合后抗体纯化方法（Purification After Mixture,PAM）  19
      2.1.2. 抗体分别纯化后再混合的方法（Mixture After Purification,MAP）  19-20
    2.2. SILAC 标记的细胞培养  20-22
      2.2.1. 培养基的配制  20-21
      2.2.2. A20 细胞培养  21
      2.2.3. A20 细胞的刺激  21
      2.2.4. 裂解细胞  21-22
    2.3. 蛋白质定量(Bradford 法)  22-23
    2.4. 免疫沉淀  23
    2.5. 聚丙烯酰胺凝胶分离  23
    2.6. 免疫印迹（Western Blot）  23-24
    2.7. 质谱样品的制备（胶内蛋白酶切、提取）[41]  24-25
    2.8. 高效液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定蛋白质  25-28
结果  28-59
  1. SILAC 技术的建立  28-33
    1.1. 细胞标记效率  28-31
    1.2. 质谱定量体系的评估  31-33
  2. 细胞模型的建立  33-36
    2.1. CD40 激活时间点的选择  33
    2.2. CD40 配体激活效果的验证  33-34
    2.3. 免疫沉淀的体系的验证  34-36
  3. 考染聚丙烯凝胶电泳分离蛋白（3 次实验）  36-37
  4. 质谱鉴定和定量结果  37-46
  5. 动态结合蛋白的功能注释  46-47
  6. 相关变化蛋白质的量的变化及功能分析  47-58
  7. CD40 与NEDD4 内源相互作用的验证  58-59
讨论  59-61
结论  61-62
参考文献  62-68
综述  68-77
  考考文献  72-77
个人简历  77-78
致谢  78

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