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猪天然抗病毒分子APOBEC3F对猪内源性反转录病毒的抑制作用研究

作　者: 孙宇
导　师: 章金刚
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: APOBEC3F 猪内源性反转录病毒荧光定量PCR 蛋白质相互作用
分类号: R392.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 75次
引　用: 2次
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内容摘要

天然免疫(Innate immunity)是机体抵御病毒感染的重要机制,是机体抗感染的第一道防线,其在获得性免疫(Adaptive immunity)活化前,发挥着抵御感染的重要作用。近年来,一些介导天然免疫的新型宿主细胞因子陆续被发现,如载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白(apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalytic polypeptide ,APOBEC)家族、三结构域蛋白家族(the tripartite motif protein family,TRIM)等。研究发现这类分子能够通过直接或间接的方式抑制病毒的复制增殖,从而使宿主感染细胞内的病毒含量下降。这些细胞内因子的发现为研究新型抗病毒药物提供了潜在的新靶标,目前已成为了研究的热点。APOBEC家族成员包括活化诱导的脱氨酶( activation-induced deaminase , AID)、APOBEC1、2及APOBEC3A~H,该类分子均具有胞嘧啶脱氨酶活性,其中抗病毒活性研究比较集中和透彻的是A3G(APOBEC3G)和A3F(APOBEC3F)。研究发现这类分子不仅可有效的阻止内源性与外源性反转录病毒的复制,还可以抑制HBV等其它非反转录病毒的复制,它们主要是通过2个胞嘧啶脱氨酶活性区对病毒复制产生的负链cDNA进行脱氨基,导致C→U的高频突变,造成病毒无法正常复制或导致病毒缺陷死亡。这类分子发挥抗病毒作用有赖于被包装入病毒粒子,在感染下一个细胞时发挥其抗病毒效应。由于APOBEC分子可直接抑制病毒复制,其抗病毒机制独特而新颖,因此将其作为宿主自身抗病毒作用的调控靶标,已经逐渐成为抗病毒感染的一条新途径。猪在异种器官移植研究上被寄予厚望,但其体内存在内源性反转录病毒(Po- rcine endogenous retrovirus,PERV),而有证据表明PERV可以体外感染人源细胞;PERV的TM蛋白与HIV的TM蛋白相似,具有抑制免疫细胞活性的作用,这使猪源器官的生物安全性受到关注。研究人员尝试了多种方法试图去除供体猪体内与器官内的PERV,但都无法达到理想的效果。如果能以猪自身的免疫机制清除PERV或将其抑制在极低的滴度范围内,那么PERV在异种器官移植上所能产生的风险就能得到有效的控制。猪体内也存在一种APOBEC分子—pA3F(Porci- ne APOBEC3F,pA3F),相关研究表明pA3F能够抑制MLV(Murine leukemia virus,MLV)及包括编码Vif(Virion infectivity factor,Vif)蛋白在内的HIV病毒复制,那么其对PERV是否也有相同的抑制作用呢?目前相关研究结果并无定论。2007年Jónsson SR.等通过长期共培养PK-15细胞与293T细胞观察猪的A3F蛋白对PERV感染293T细胞的抑制作用,其研究发现猪的pA3F无法抑制PERV对293T细胞的感染;但2011年D(?)rrschuck E.等通过PERV B感染性克隆与猪A3F相互作用发现,猪的A3F蛋白能够抑制PERV对293T细胞感染。为进一步澄清pA3F是否具有抑制PERV复制的功能及其可能机制,我们通过对PK-15细胞中的PERV与pA3F的相互作用研究发现:1. pA3F具有抑制PERV的复制功能:我们在PK-15细胞中利用pA3F过表达及RNA干扰等手段,通过相对荧光定量PCR及ELISA方法对PERV pol基因mRNA及PERV反转录酶变化进行检测发现,在pA3F过表达的PK-15细胞中PERV pol基因mRNA与PERV反转录酶水平与对照相比显著降低(p<0.05),在转染30μg pA3F表达载体的实验组改变最显著,PERV pol基因mRNA变化倍数达到0.252±0.032,反转录酶降低至6.85±0.69pg/孔,且变化与pA3F的表达量之间具有剂量依赖关系;在pA3F下调细胞中PERV pol基因mRNA与PERV反转录酶水平与对照组比较显著提高(p<0.05),其中以沉默pA3F的740-764bp的序列最有效,pol基因mRNA增长4.172±0.251倍,反转录酶达到88.58±1.46pg/孔。实验结果说明,PK-15细胞中pA3F对PERV的复制具有抑制作用。2. pA3F通过PERV gag蛋白的协助包装进病毒粒子发挥抗病毒作用:本研究通过免疫共沉淀实验证实pA3F与PERV gag蛋白能够形成复合物;激光共聚焦扫描显微镜细胞共定位观察也证实两种蛋白在PK-15细胞中存在共定位;pA3F基因转染的PK- 15细胞培养上清收集的PERV病毒粒子,免疫印迹检测证实病毒粒子中含有pA3F蛋白。以上实验结果说明pA3F是在PERV gag蛋白的协同下被包装进了PERV病毒粒子从而发挥其抑制PERV的作用。综上所述,本研究发现pA3F蛋白可以抑制PERV的复制,在此基础上进一步阐明了其可能的作用机制,不但为利用猪自身的免疫防御清除或抑制PERV提供了新靶标,而且有可能对猪源异种器官移植的生物安全性找到了新的解决途径。

全文目录

缩略词表（Abbreviation）  7-9
摘要  9-11
Abstract  11-13
前言  13-17
材料与方法  17-37
  1. 材料  17-19
    1.1 实验动物  17
    1.2 菌株、细胞株及质粒  17
    1.3 分子生物学试剂及工具酶  17-18
    1.4 主要仪器  18
    1.5 细胞培养用品  18
    1.6 基本溶液配制  18-19
  2. 猪APOBEC3F 基因的克隆  19-23
    2.1 猪APOBEC3F 基因克隆的引物设计与合成  19
    2.2 五指山猪外周血单个核细胞的分离  19
    2.3 PBMC 总RNA 的制备  19-20
    2.4 反转录合成cDNA  20
    2.5 PCR 扩增  20
    2.6 pCDNA3-Flag-pA3F 载体的构建与鉴定  20-22
      2.6.1 pCDNA3-Flag-pA3F 载体的构建  20-21
      2.6.2 pCDNA3-Flag-pA3F 载体鉴定  21-22
    2.7 pA3F 基因在PK-15 细胞中的表达与鉴定  22-23
      2.7.1 质粒的准备  22-23
      2.7.2 细胞培养与转染  23
      2.7.3 pA3F 在PK-15 细胞中表达鉴定  23
  3.pA3F 抑制PERV 病毒复制鉴定  23-28
    3.1 pA3F 过表达对PERV 复制抑制作用鉴定  23-27
      3.1.1 pA3F 在PK-15细胞中梯度表达鉴定  23-25
      3.1.2 pA3F过表达抑制PERV pol m RNA的水平  25-26
      3.1.3 pA3F 过表达抑制PERV 反转录酶水平  26-27
    3.2 RNAi 沉默pA3F 基因与PERV 增殖的改变  27-28
      3.2.1 pA3F 基因沉默与PERV 增殖改变  27-28
      3.2.2 PERV反转录酶检测  28
  4.pA3F 蛋白实现在PERV 粒子中的包装鉴定  28-30
    4.1 转染质粒准备  28-29
    4.2 细胞培养与转染  29
    4.3 PERV病毒分离  29
    4.4 PERV 对pA3F 蛋白的包装鉴定  29-30
  5.PERV gag 基因的克隆  30-32
    5.1 PERV gag 基因克隆的引物设计与合成  30-31
    5.2 PERV病毒的增殖与分离  31
    5.3 PERV病毒基因的提取  31
    5.4 反转录合成cDNA  31
    5.5 PCR 扩增  31
    5.6 PCR 扩增产物的克隆与鉴定  31
    5.7 PERV gag基因在K-15细胞中的表达与鉴定  31-32
  6.pA3F 蛋白与PERV gag 蛋白之间的相互作用鉴定  32-34
    6.1 转染质粒的准备  32
    6.2 细胞培养与转染  32-33
    6.3 免疫沉淀与免疫印迹  33-34
  7.pA3F蛋白与PERV gag蛋白细胞内共定位观察  34-37
    7.1 荧光质粒的构建与鉴定  34-35
      7.1.1 引物设计与合成  34
      7.1.2 PCR 扩增目的基因  34-35
      7.1.3 荧光载体构建与鉴定  35
    7.2 转染质粒的准备  35
    7.3 细胞培养与转染  35-36
    7.4 标本制备  36
    7.5 激光共聚焦扫描显微镜观察共定位  36-37
结果  37-55
  1 pA3F 基因扩增与鉴定  37-39
  2 pA3F 基因表达产物鉴定  39
  3 pA3F 抑制PERV 复制鉴定  39-43
    3.1 pA3F 在PK-15 细胞中的梯度表达鉴定  39-40
    3.2 pA3F 过表达细胞中PERV pol 基因m RNA 改变  40-42
    3.3 PERV反转录酶改变  42-43
      3.3.1 标准曲线制作  42
      3.3.2 反转录酶检测  42-43
  4 pA3F 基因沉默与PERV 增殖的改变  43-46
    4.1 pA3F 基因沉默与PERV pol m RNA 水平改变  43-45
    4.2 PERV反转录酶检测  45-46
  5 pA3F 实现在 PERV 颗粒中包装鉴定  46-48
  6 PERV gag 基因扩增与鉴定  48-50
  7 PERV gag 基因表达与鉴定  50-51
  8 pA3F与PERV gag蛋白之间的相互作用鉴定  51-52
  9 pA3F 与PERV gag 蛋白共定位观察  52-55
讨论  55-61
  1 APOBEC 家族的抗病毒作用与对PERV 抑制  55-56
  2 pA3F 抗病毒机制  56-58
  3 反转录病毒对APOBEC分子的抑制作用逃逸  58
  4 pA3F 抑制PERV 作用的意义  58-61
结论  61-63
参考文献  63-71
文献综述  71-83
  参考文献  79-83
附录  83-85
个人简历  85-87
致谢  87

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