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血小板在库存红细胞输注增强患者炎症反应中的作用及机制研究

作　者: 王晓伟
导　师: 王全立
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 血小板库存红细胞细胞因子炎症
分类号: R392.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景同种异体输血(allogeneic blood transfusion, ABT)在临床抢救病人过程中发挥着重要作用，但同种异体输血在挽救生命的同时，也会并发很多免疫相关的副反应。输血相关免疫调节(transfusion-related immunomodulation,TRIM)[1]是输入同种异体血液导致免疫系统改变的以免疫抑制为特征的综合征，临床常见的并发TRIM导致免疫抑制的严重后果为术后感染和肿瘤的复发与转移。悬浮红细胞在保存过程中，含有的白细胞及血小板可以释放多种生物活性物质，这些生物活性物质的浓度会随着保存时间的延长而升高，当这些生物活性物质进入机体后有可能导致受者免疫状态发生改变，导致TRIM的后果。TRIM发生的确切机制尚不清楚。目前的研究已知，各种刺激信号必须与其相应靶细胞膜上的受体结合，通过其特定的信号传导通路发挥生物学作用。最近的研究中发现血小板不仅在止血和凝血过程中发挥重要作用，血小板还参与了很多炎症反应。血小板是外周血体积最小的血细胞，由巨核细胞的胞浆部分脱落形成，含有致密颗粒和α颗粒，激活后可以释放多种细胞因子和生长因子，如可溶性CD40配体（sCD40L）、肿瘤坏死因子α （TNF-α）、白细胞介素1β （IL-1β）、转化生长因子β （TGFβ）、RANTES等。在红细胞保存过程中，血小板非常容易活化，从而释放大量生物活性因子，关于这些生物活性因子在TRIM中的作用，，国内外相关文献报道较少。目的探讨血小板在输注库存红细胞增强患者炎症反应中的作用及机制。方法1.库存红细胞上清制备：取新鲜采集悬浮红细胞3袋，用无菌接合机与无菌空袋接合混合后，放置在4℃冰箱中保存。分别于7d、21d、35d用无菌接合机与无菌空袋接合留取样本，通过4000g离心，将红细胞上层液体挤入无菌空袋，得到含有少量红细胞的上清，大约130ml。将此上清以无菌的方式倒入无菌EP管中，以10000g离心，以去除红细胞，得到红细胞上清。将此上清分装成6分，放入-80℃冰箱保存。2.实验分组：将150ml新采集的机采血小板用同型血浆稀释后，用无菌接合机与血小板保存袋连接挤入40ml血小板，依此方法再重复12次。任选其中4袋血小板以无菌的方式全部加入7d库存红细胞上清5ml，然后将其中3袋分别以无菌方式加入浓度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS45ul并标记好。再选剩余血小板中4袋血小板以无菌的方式全部加入28d库存红细胞上清5ml，然后将其中3袋分别以无菌方式加入45ul浓度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS并标记好。再选剩余血小板中4袋血小板以无菌的方式全部加入35d库存红细胞上清5ml，然后将其中3袋分别以无菌方式加入45μ l浓度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS并标记好。最后剩下一袋血小板什么都不加，即：A组：对照组，稀释后的机采血小板40ml。B组：加入5ml7d或21d或35d红细胞上清的45ml机采血小板。C组：加入5ml7d或21d或35d红细胞上清和45μ l浓度为10ng/ml的LPS的机采血小板45ml。D组：加入5ml7d或21d或35d红细胞上清和45μ l浓度为100ng/ml的LPS的机采血小板45ml。E组：加入5ml7d或21d或35d红细胞上清和45μ l浓度为1000ng/ml的LPS的机采血小板45ml。3.结果检测：分别于3h、6h、24h以无菌方式在血小板中取出10ml，其中1ml用于血小板凋亡、活化检测，2ml用于细胞因子检测，其余用于血小板聚集率及低渗性休克检测。使用流式细胞仪检测CD62P及血小板凋亡；血小板低渗休克反应采用分光光度法检测；血小板聚集率使用血小板聚集仪检测；CD40L、5-HT、TGF-β1、RANTES、IL-1β、TNF-α使用酶联免疫吸附法检测。结果1. sCD40L检测结果在各组加入不同库存红细胞上清孵育后相同检测时间点，sCD40L浓度随库存红细胞上清时间延长而增加（P＜0.05）；在相同库存红细胞上清中，sCD40L浓度随血小板保存时间延长而增加（P＜0.05）；在同等条件下，sCD40L浓度随溶液中LPS浓度增加而增加（P＜0.05）。2.5-HT检测结果在各组加入不同库存红细胞上清孵育后相同检测时间点，5-HT浓度随库存红细胞上清时间延长而增加（P＜0.05）；在相同库存红细胞上清中，5-HT浓度随血小板保存时间延长而增加（P＜0.05）；在同等条件下，5-HT浓度随溶液中LPS浓度增加而增加（P＜0.05）。3. TGF-β1检测结果在各组加入不同库存红细胞上清孵育后相同检测时间点，TGF-β1浓度随库存红细胞上清时间延长而增加（P＜0.05），在相同库存红细胞上清中，TGF-β1的释放在3h、6h处没有差别（P＞0.05），在7d红细胞上清的刺激下TGF-β1的释放并没有随时间的延长而增加（P＞0.05）），但在21d、35d红细胞上清刺激下，TGF-β1在24h处释放明显增加（P＜0.05）；在同等条件下，TGF-β1浓度随溶液中LPS浓度增加而增加（P＜0.05）。4. RANTES检测结果在各组加入不同库存红细胞上清孵育后相同检测时间点，RANTES浓度随库存红细胞上清时间延长而增加（P＜0.05），在相同库存红细胞上清中，RANTES的释放在6h、24h处没有差别（P＞0.05），但与3h相比差异明显（P＜0.05）。在同等条件下，RANTES浓度随溶液中LPS浓度增加而增加（P＜0.05）。5. IL-1β检测结果在7d上清刺激下，IL-1β的释放随保存时间延长而增加（P＜0.05）；在21d、35d上清刺激下，3h、6h处IL-1β的释放并未随时间延长而增加（P＞0.05），但在24h处IL-1β的释放随时间延长而增加（P＜0.05）。在各组加入不同库存红细胞上清孵育后相同检测时间点，IL-1β的释放随保存红细胞上清时间延长而增加（P＜0.05）。在同等条件下，IL-1β的浓度随溶液中LPS浓度增加而增加（P＜0.05）。6. CD62检测结果在7d上清刺激下，CD62P的表达在6h、24h处并未随时间延长而增加（P＞0.05）；在21d、35d上清刺激下，CD62P的表达随时间延长而增加（P＜0.05）。在同等条件下，CD62P的表达随溶液中LPS浓度增加而增加（P＜0.05）。7.血小板聚集率检测在各组加入不同库存红细胞上清孵育后相同检测时间点，血小板聚集率随库存红细胞上清时间延长而降低（P＜0.05），在相同库存红细胞上清中，血小板聚集率随库存红细胞上清时间延长而降低（P＜0.05）；在同等条件下，血小板聚集率随溶液中LPS浓度增加而降低（P＜0.05）。8.血小板低渗性休克检测结果在各组加入不同库存红细胞上清孵育后相同检测时间点，血小板低渗性休克率随库存红细胞上清时间延长而降低（P＜0.05）；在相同库存红细胞上清中，血小板低渗性休克率随库存红细胞上清时间延长而降低，但不具有统计学意义（P＞0.05）；在同等条件下，血小板低渗性休克率随溶液中LPS浓度增加而降低（P＜0.05）。9.AnnexinV检测结果在各时间点及各红细胞上清刺激下统计结果均无明显差异（P＞0.05）。10. TNF-α检测结果所有样本中均未检测到TNF-α。结论1.悬浮红细胞保存时间越长，其上清刺激血小板产生致炎因子的能力越强。2.悬浮红细胞保存时间越长，其上清对血小板的聚集功能影响越大。3.溶液中LPS浓度越大，血小板越容易活化和产生致炎因子。

全文目录

中英文缩略词汇对照  6-8
中文摘要  8-12
Abstract  12-17
前言  17-19
1. 材料与方法  19-31
  1.1 一般资料  19
  1.2 仪器与试剂  19-20
  1.3 方法  20-31
    1.3.1 库存红细胞上清制备  20
    1.3.2 溶液配制  20-21
    1.3.3 实验分组  21-22
    1.3.4 操作方法  22-31
      1.3.4.1 细胞因子检测  22-29
        （1）5-羟色胺（5-HT）检测  22-23
        （2）TGF-β1 检测  23-25
        （3）RANTES 检测  25-26
        （4）sCD40L 检测  26-28
        （5）IL-1β检测  28
        （6）TNF-α检测  28-29
      1.3.4.2 血小板活化、凋亡检测  29-30
        （1）血小板活化检测  29
        （2）血小板凋亡检测  29-30
      1.3.4.3 血小板聚集率、低渗休克检测  30-31
        （1）血小板聚集率检测  30
        （2）血小板低渗休克检测  30-31
  1.4 统计学分析  31
2. 结果  31-42
  2.1 细胞因子检测结果  31-38
    2.1.1 sCD40L 检测结果  31-32
    2.1.2 5-HT 检测结果  32-34
    2.1.3 TGF-β1 检测结果  34-35
    2.1.4 RANTES 检测结果  35-36
    2.1.5 IL-1β检测结果  36-37
    2.1.6 TNF-α检测结果  37-38
  2.2 血小板活化、凋亡检测结果  38-39
    2.2.1 CD62 检测结果  38-39
    2.2.2 AnnexinV 检测结果  39
  2.3 血小板功能检测  39-42
    2.3.1 血小板聚集率检测  39-40
    2.3.2 血小板低渗休克检测  40-42
3. 讨论  42-44
4. 结论  44-45
参考文献  45-47
血小板在疾病中作用研究进展  47-53
  参考文献  50-53
库存红细胞增强脂多糖诱导的外周血单个核细胞炎症反应机制的研究  53-61
  参考文献  60-61
个人简历  61-62
致谢  62

血小板在库存红细胞输注增强患者炎症反应中的作用及机制研究

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