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罗非鱼源无乳链球菌灭活疫苗的研制及其免疫效果的研究

作　者: 陈贺
导　师: 简纪常
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 无乳链球菌疫苗免疫效果培养条件优化佐剂
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

近年来我国罗非鱼养殖业发展迅速，但罗非鱼相关疾病的爆发频繁发生，特别是链球菌病，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。本研究主要针对无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）对中国罗非鱼养殖业造成巨大的危害情况，以制备的无乳链球菌灭活疫苗为研究对象，主要进行了无乳链球菌的分离鉴定及致病性分析、无乳链球菌培养条件的优化、无乳链球菌疫苗对吉富罗非鱼的免疫保护试验。试验从广东、广西、海南的罗非鱼主养区发病的罗非鱼体内分离出40株链球菌，通过传统方法及16SrRNA分子生物学方法相结合的手段对分离的致病性菌株进行鉴定，最终确定40株菌均为无乳链球菌，证明了无乳链球菌是华南地区罗非鱼链球菌病的主要病原。实验还选取6株具有区域代表性的菌株对罗非鱼进行了致病性分析，以研究不同地区的菌株之间毒力的差异，筛选具有较好免疫原性的菌株作为制备疫苗的候选菌株。结果显示，分离于广东湛江的无乳链球菌显示出较强的毒力，适合作为制备疫苗的候选菌株。针对无乳链球菌的培养与生长特性，本试验探讨了脑心浸液（Brian HeartInfusion，BHI）培养基的营养因子、初始pH值、溶氧、温度等因素对无乳链球菌生长的影响，并采用正交实验法对无乳链球菌培养基营养因子添加量进行优化，寻求无乳链球菌培养的最佳参数，以期为无乳链球菌疫苗的研制提供基础资料。结果表明，无乳链球菌生长的最适初始pH为7～8，培养温度为28～37℃，振荡转速为180～200rpm，在BHI培养基中添加2mg/mL的葡萄糖和20mg/mL的酵母粉即可在对数期获得最大细菌量。本研究采用注射和浸泡2种免疫方法，对用无乳链球菌临床分离株ZJ02福尔马林灭活制备的疫苗进行了免疫保护效果的研究。注射组以四个不同浓度的白油佐剂灭活疫苗免疫吉富罗非鱼；浸泡组以相同浓度的灭活疫苗分别与消旋山莨菪碱、脂肪醇聚氧乙烯醚和氯化钠三种不同佐剂免疫吉富罗非鱼。在免疫后的不同时间里对试验鱼进行尾静脉采血，测定罗非鱼血清中抗体效价水平、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活力、过氧化氢酶活性和丙二醛含量。结果显示，无乳链球菌疫苗对罗非鱼具有较强的免疫原性，免疫组与对照组相比，血清中的抗体效价水平均显著性提高，注射组和浸泡组的抗体效价最高分别达到1:256和1:128；注射组中不同浓度的疫苗免疫组获得了较高的免疫保护率，高浓度组可达到95％；浸泡组中使用3种佐剂的免疫组免疫保护率分别为59％、64％、55％。免疫后罗非鱼血清中的抗体效价水平、溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活力、过氧化氢酶活性和丙二醛含量与对照组差异显著（P<0.05）。上述结果表明，无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼具有很好的免疫保护性，有效的提高了罗非鱼对无乳链球菌的免疫力，免疫剂量对注射免疫效果有显著性影响，不同免疫佐剂对浸泡免疫效果具有不同的免疫保护率。本研究旨在为无乳链球菌引起的鱼类疾病防治提供技术支撑。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-13
1 文献综述  13-20
  1.1 鱼类无乳链球菌的研究进展  13-16
    1.1.1 病原  13
    1.1.2 生理生化特性  13
    1.1.3 症状与组织病理学  13-14
    1.1.4 致病机理  14
    1.1.5 病原菌的鉴定  14-15
    1.1.6 流行病学  15-16
  1.2 鱼类疫苗的研究进展  16-20
    1.2.1 鱼类疫苗的种类  16-18
    1.2.2 鱼类疫苗佐剂  18-19
    1.2.3 疫苗的免疫途径  19-20
2 罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究  20-27
  2.1 实验材料  20
    2.1.1 主要试剂  20
    2.1.2 溶液配制  20
    2.1.3 实验用鱼  20
    2.1.4 主要仪器  20
  2.2 实验方法  20-23
    2.2.1 病原菌的分离与培养  20-21
    2.2.2 革兰氏染色  21
    2.2.3 16SrRNA 鉴定  21-23
    2.2.4 分离菌对罗非鱼的致病性研究  23
  2.3 结果与分析  23-25
    2.3.1 分离培养及染色结果  23-24
    2.3.2 16S rRNA 鉴定结果  24
    2.3.3 致病性实验结果  24-25
  2.4 讨论  25-27
3 无乳链球菌培养基及培养条件的优化研究  27-36
  3.1 材料  27
    3.1.1 主要材料  27
  3.2 方法  27-28
    3.2.1 无乳链球菌的培养  27
    3.2.2 菌体浓度的检测  27
    3.2.3 温度对无乳链球菌生长的影响  27
    3.2.4 初始 pH 值对无乳链球菌生长的影响  27
    3.2.5 振荡培养对无乳链球菌生长的影响  27-28
    3.2.6 葡萄糖对无乳链球菌生长的影响  28
    3.2.7 酵母粉对无乳链球菌生长的影响  28
    3.2.8 无乳链球菌培养基营养因子添加量的优化  28
    3.2.9 无乳链球菌在优化条件下的生长动态  28
  3.3 结果与分析  28-34
    3.3.1 温度对无乳链球菌生长的影响  28-29
    3.3.2 初始 pH 对无乳链球菌生长的影响  29
    3.3.3 溶氧对无乳链球菌生长的影响  29-30
    3.3.4 葡萄糖添加量对无乳链球菌生长的影响  30
    3.3.5 酵母粉添加量对无乳链球菌生长的影响  30-31
    3.3.6 培养基优化的正交实验  31-32
    3.3.7 无乳链球菌在优化条件下的生长动态  32-34
  3.4 讨论  34-36
    3.4.1 无乳链球菌培养条件的优化  34
    3.4.2 无乳链球菌培养基的优化  34-35
    3.4.3 无乳链球菌在优化条件下的生长动态  35-36
4 无乳链球菌疫苗的制备  36-40
  4.1 实验材料  36
    4.1.1 实验用鱼  36
    4.1.2 主要试剂  36
    4.1.3 溶液配制  36
    4.1.4 主要仪器  36
  4.2 实验方法  36-38
    4.2.1 菌株的活化及培养  36-37
    4.2.2 菌株半数致死量测定  37
    4.2.3 菌株灭活条件的筛选  37
    4.2.4 疫苗的制备  37
    4.2.5 疫苗的质量及安全性检测  37-38
  4.3 结果与分析  38-39
    4.3.1 半数致死量测定结果  38
    4.3.2 灭活条件实验结果  38-39
    4.3.3 疫苗的质量及安全性检测结果  39
  4.4 讨论  39-40
5 无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼免疫功能的影响  40-54
  5.1 实验材料  40
    5.1.1 实验用鱼  40
    5.1.2 主要试剂  40
    5.1.3 溶液配制  40
  5.2 实验方法  40-44
    5.2.1 疫苗的免疫方式及程序  40-41
    5.2.2 血清收集及处理  41
    5.2.3 血清抗体效价的检测  41
    5.2.4 血清溶菌酶活性的检测  41
    5.2.5 血清超氧化物歧化酶活力的检测  41-42
    5.2.6 血清过氧化氢酶活力的检测  42
    5.2.7 血清丙二醛的检测  42-43
    5.2.8 攻毒实验  43
    5.2.9 统计学处理  43-44
  5.3 结果与分析  44-50
    5.3.1 抗体效价检测结果  44-45
    5.3.2 溶菌酶检测结果  45-46
    5.3.3 超氧化物歧化酶检测结果  46-47
    5.3.4 过氧化氢酶检测结果  47-48
    5.3.5 丙二醛检测结果  48
    5.3.6 攻毒实验及疫苗免疫保护性结果  48-50
  5.4 讨论  50-54
    5.4.1 疫苗对罗非鱼免疫保护效果的影响  50-51
    5.4.2 疫苗对罗非鱼抗体效价的影响  51
    5.4.3 疫苗对罗非鱼血清溶菌酶和超氧化物歧化酶活力的影响  51-52
    5.4.4 疫苗对罗非鱼血清过氧化氢酶和丙二醛的影响  52
    5.4.5 佐剂对疫苗免疫保护效果的影响  52-53
    5.4.6 免疫方法对疫苗免疫保护效果的影响  53-54
结论  54-55
参考文献  55-62
致谢  62-63
作者简介  63-64
导师简介  64

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