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刚地弓形虫RH株和Pru株感染小鼠miR-29和IFN-γ的表达变化

作　者: 张洁
导　师: 王勇
学　校: 南京医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 弓形虫毒力株 IFN-γ miR-29
分类号: R382.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是人兽共患的胞内寄生原虫。刚地弓形虫是一种机会性致病原虫，在宿主免疫力正常的情况下，大多表现为隐性感染状态，而当机体免疫功能下降或受抑制(如恶性肿瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)时，处于隐性感染状态的虫体就会活化，迅速增生繁殖，破坏宿主细胞，引起多器官的损害，如弓形虫脑炎，严重者可导致宿主死亡。孕妇感染弓形虫后可引起流产、早产、死胎、畸形或智能低下等。从动物和人体分离的刚地弓形虫均属于同一个种。根据基因连锁图谱，刚地弓形虫基因型可分为三个型，即typeI，typeII和typeIII。一般根据鼠感染后的毒力将弓形虫分为鼠毒力株(murine viurlent，以RH株为代表)和无毒力株(murineavirulent，以Pru株为代表)。但是这些分型研究仍不能全面解释不同弓形虫分离株，在致病力、抗原种类、宿主免疫反应等生物学特性方面存在的明显差异。IFN-γ具有抗病毒、抗胞内寄生菌、抗胞内寄生原虫、抗细胞增殖的作用。急性弓形虫感染阶段，速殖子在体内迅速增殖，机体对其免疫应答主要为IFN-γ介导的细胞免疫。弓形虫感染宿主IFN-γ来源于NK细胞和活化T细胞。已有研究证实，不同毒株弓形虫感染，分泌表达不同水平的IFN-γ。近年的研究揭示，microRNA参与多种重要的生理和病理过程，在弓形虫感染已有涉及。目前各种软件预测发现，miR-29存在较多的可能靶基因，包括参与细胞增殖、分化、凋亡、迁移和免疫调节等多种生物学过程的相关基因和病毒基因等。最近研究证实，在胞内菌李斯特菌感染中，miR-29能结合IFN-γ的3’UTR区域，参与IFN-γ基因的转录。那么，在不同毒株弓形虫感染中miR-29是否也有表达？其表达是否有差异？以及和IFN-γ表达间是否存在联系？综合上述资料，本研究旨在探讨弓形虫强、弱毒力株感染小鼠后，miR-29表达的差异及与IFN-γ间的关系。我们首先建立刚地弓形虫感染小鼠模型，并设立对照组。分别用分离的弓形虫RH株速殖子和Pru株包囊感染C57BL/6小鼠，在感染后的不同时间点，采用ELISA法检测血清IFN-γ表达水平，实时荧光定量PCR方法检测血清miR-29表达，实时荧光定量PCR方法检测NK细胞、CD4~+T细胞和CD8~+T细胞分泌IFN-γ水平及miR-29表达情况等。本研究获得如下主要结果：1.弓形虫RH株和Pru株感染小鼠血清IFN-γ水平ELISA法检测小鼠感染后2、4和6天及正常对照小鼠血清IFN-γ表达。与正常对照组相比，感染后2天血清IFN-γ水平开始上升，但差异无统计学意义。感染后4天和6天，血清IFN-γ水平显著提高（P<0.001），并且RH株感染组IFN-γ水平显著高于Pru株感染组。2.弓形虫RH株和Pru株感染小鼠NK细胞、CD4~+T细胞和CD8~+T细胞IFN-γ表达水平磁珠分选RH株和Pru株感染小鼠与正常小鼠NK细胞、CD4~+T细胞和CD8~+T细胞，提取各细胞总RNA，实时荧光定量PCR检测IFN-γ mRNA表达情况。结果显示，与正常对照组相比，RH株和Pru株感染小鼠NK细胞IFN-γ水平均于感染2天后开始增加，于感染后4天和6天进一步增加（P<0.001）。CD4~+T细胞的IFN-γ表达水平均于感染2天后开始增加，感染后4天和6天也进一步增加（P<0.01）。RH株CD8~+T细胞IFN-γ水平于感染2天后开始增加，感染后6天结果进一步增加。Pru株CD8~+T细胞IFN-γ水平于感染4天后才开始出现明显增加，到感染后6天进一步增加（P<0.01）。RH株IFN-γ增加的幅度高于Pru株。3.弓形虫RH株和Pru株感染小鼠血清miR-29表达提取RH株和Pru株感染小鼠2、4和6天及正常小鼠血清总RNA，实时荧光定量PCR检测血清miR-29表达。结果显示，与同期对照组相比，感染组血清中miR-29表达下降，其中强毒株RH株感染后2、4和6天，小鼠血清miR-29水平均下降（P<0.01），弱毒株Pru株感染后6天miR-29出现降低（P<0.05）。4.弓形虫RH株和Pru株感染小鼠NK细胞、CD4~+T细胞和CD8~+T细胞miR-29表达情况实时荧光定量PCR结果显示，与正常对照组相比，感染组NK细胞miR-29表达均下降，RH株感染组miR-29表达于感染后2天即出现明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）；随着感染天数增加，miR-29表达水平进一步下降（P<0.001）。而Pru株感染组miR-29表达水平于感染后4天呈现明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。CD4~+T细胞miR-29表达总体呈下降趋势，RH株感染组miR-29a表达水平于感染后2天即出现明显下降，差异有统计学意义（P<0.01），而miR-29b于感染后6天才出现下降，差异有统计学意义（P<0.05）；Pru株感染组miR-29a和miR-29b表达水平均于感染后4天出现明显下降，差异有统计学意义。RH株感染组CD8~+T细胞miR-29a和miR-29b表达水平，于感染后4天出现下降，差异有统计学差异（P<0.001），感染后第2和第6天，miR-29a和miR-29b表达水平差异无统计学意义，而Pru株感染组miR-29a未见明显变化，miR-29b于感染后2d却略呈上升趋势。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
一前言  11-14
二材料和方法  14-33
三结果  33-46
四讨论  46-51
五小结  51-52
参考文献  52-69
附录  69-70
致谢  70

刚地弓形虫RH株和Pru株感染小鼠miR-29和IFN-γ的表达变化

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