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幽门螺杆菌cagA转基因小鼠胃病理表型与分析

作　者: 林维石
导　师: 刘纯杰
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: 幽门螺杆菌转基因小鼠 CagA 多态性癌前病变
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）的发现是20世纪胃肠病学领域的一大重要事件。现已明确H.pylori是慢性胃炎、胃和十二指肠消化性溃疡、胃腺癌和胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤的主要病因。1994年世界卫生组织将其归为Ι类致癌因子。H.pylori的毒力致病因子主要包括：尿素酶、鞭毛、黏附素、脂多糖、空泡毒素及细胞毒素相关蛋白CagA等。通常以H.pylori是否表达VacA和CagA毒力蛋白进行分型，其中I型H.pylori具有典型的以cagA为标志的细菌致病岛(cag pathogenicity island)，称其为cag PAI。在大量的研究中证明，是否含有cagPAI是H.pylori具有较强毒力的重要标示，同时在H.pylori的致病过程中cag PAI也起到了重要的作用。CagA蛋白具有多态性，其C端的EPIYA基序在来自东亚型和西方型的H.pylori中有明显的不同。细胞实验表明，西方型和东亚型H.pylori的CagA蛋白其致病能力不同。但由于H.pylori具有多种致病因子，长期感染H.pylori的动物模型并不能演示单一CagA蛋白的致病作用。而cagA转染AGS细胞虽可揭示CagA的致病机制，并避免H.pylori其他致病因子的影响，但并不能准确模拟H.pylori在体内的致病过程。基于以上原因，本课题组成功建立了东亚型（cagA-9810，羧基端含有EPIYA-ABD基序）和西方型（cagA-Ca52，羧基端含有EPIYA-ABC基序）2个品系的转基因小鼠模型。本课题在此工作基础上进行了如下三个方面的研究：1.在DNA水平进行了cagA基因整合拷贝数与完整性检测为了确保CagA蛋白在cagA转基因小鼠体内进行有效表达，在得到cagA-9810和cagA-Ca52二个品系转基因小鼠子代后，我们首先对2个品系4个亚系小鼠染色体上所插入的cagA片段的拷贝数进行了检测，结果表明cagA-Ca52品系的AC155亚系、GC996亚系和cagA-9810品系的YB081亚系、YB053亚系小鼠基因组所插入的cagA基因片段拷贝数分别为5、8、6、6拷贝。其次我们检测了转基因小鼠插入cagA基因片段的完整性，分别在cagA基因5’端和3’端靶序列区域设计PCR引物并进行PCR扩增，在所有品系和亚系的小鼠均检测到了阳性扩增条带，且测序正确。2.进行了小鼠体内CagA表达水平检测在经过DNA水平检测后，我们在RNA水平对cagA基因的转录情况进行了检测。提取小鼠胃组织RNA，进行RT-PCR，结果表明cagA转基因阳性小鼠可以进行cagA基因转录，且扩增产物测序结果正确。以CagA蛋白及其C端连接的HA标签为靶标进行了Western-Blot检测。结果表明CagA蛋白在cagA转基因阳性小鼠体内获得了表达。3.CagA表达阳性小鼠胃病理表型分析我们针对6-18月龄的cagA-Ca52和cagA-9810品系共148只小鼠进行了病理解剖学和病理组织学观察，其中cagA-Ca52阳性小鼠57只，cagA-9810阳性小鼠59只，同窝阴性对照小鼠32只。结果表明：CagA表达阳性小鼠的胃部发生的了明显的炎症、息肉样增生、腺瘤样增生及肠化生等病变，其中息肉样增生、腺瘤样增生及肠化生可列为癌前病变。以Ki-67抗体进行免疫组化染色分析，发现在部分病变小鼠胃粘膜腺颈部、胃小凹、胃底腺出现了细胞核深染，细胞增殖旺盛的现象。经阿尔新蓝染色发现部分小鼠胃底腺出现肥大粘液细胞。统计表明，东亚型cagA转基因小鼠发生癌前病变比例为51%，西方型转基因小鼠发生癌前病变比例为28%。两个品系的转基因小鼠在观察期限内胃部及十二指肠都没有发现明确的癌症病灶，但是CagA表达阳性小鼠发生疾病的比例要远高于同笼阴性对照组小鼠，且观察到了癌前病变。总之，在获得了东亚型cagA转基因小鼠cagA-9810（EPIYA-ABD）和西方型转基因小鼠cagA-Ca52(EPIYA-ABC)后，经过对转基因小鼠DNA、RNA及蛋白水平的检测，以及病理学、病理组织学、免疫组化染色和特殊染色分析，得出如下结论：东亚型CagA蛋白（EPIYA-ABD）和西方型CagA蛋白(EPIYA-ABC)均可引起转基因小鼠的胃部发生明显的病理变化，且东亚型CagA蛋白的致病作用要强于西方型CagA蛋白。

全文目录

缩略词表  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-16
  1 幽门螺杆菌的主要致病因子  11-12
  2 CagA 蛋白在幽门螺杆菌致病过程中的作用  12-14
  3 建立 cagA 转基因小鼠及对其研究的价值与意义  14-16
第一章 cagA 转基因小鼠整合基因拷贝数与完整性检测  16-31
  第一节利用实时荧光定量比较 Ct 法检测插入 cagA 片段拷贝数  17-22
    1 材料  17
    2 方法  17-19
    3 结果  19-22
  第二节检测插入 cagA 片段完整性  22-27
    1 材料  22-23
    2 方法  23-25
    3 结果  25-27
  第三节小鼠信息统计及 cagA+检测  27-31
    1 材料  27
    2 方法  27-28
      2.1 鼠尾提取 DNA  27
      2.2 引物设计及合成  27
      2.3 cagA 片段 PCR  27-28
    3 结果  28-29
    4 讨论  29-31
第二章小鼠体内 CagA 表达水平检测  31-41
  1 材料  31
  2 方法  31-36
    2.1 小鼠组织 RNA 的提取  31-32
    2.2 RT-PCR 检测 cagA 在小鼠胃组织内的转录及扩增产物测序  32-34
    2.3 小鼠胃总蛋白提取  34
    2.4 Western Blot  34-36
  3.结果  36-39
    3.1 RT-PCR 检测 cagA 转录水平及扩增产物测序结果  36-39
    3.2 Western-Blot 对 CagA 蛋白表达检测结果  39
  4 讨论  39-41
第三章 cagA 转基因小鼠的组织病理学分析  41-55
  1 材料  41
  2 方法  41-44
    2.1 小鼠病理学解剖  41-42
    2.2 HE 切片染色  42-43
    2.3 Ki-67 核增殖抗原免疫组织化学染色  43
    2.4 阿尔新蓝染色  43-44
  3 结果  44-53
    3.1 眼观病理检查结果  44-45
    3.2 病理组织切片观察结果  45-52
    3.3 cagA 转基因小鼠病理表型统计结果  52-53
  4 讨论  53-55
    4.1 东亚型与西方型 CagA 蛋白致病差异  53
    4.2 关于 CagA 蛋白的致病效应  53-55
全文总结  55-56
参考文献  56-61
附录  61-66
综述  66-74
  参考文献  70-74
发表文章  74-84
致谢  84-85
个人简介  85

幽门螺杆菌cagA转基因小鼠胃病理表型与分析

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