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黑龙江立克次体感染BALB/c小鼠的致病性研究

作　者: 段长松
导　师: 温博海
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 黑龙江立克次体感染动物模型致病机制
分类号: R376
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)属于斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsiae,SFGR),是远东斑点热(Far-eastern spotted fever, FESF)的病原体。黑龙江立克次体为专性胞内寄生的革兰氏阴性小杆菌,在保存宿主蜱中经卵传播,通过蜱的叮咬感染人。远东斑点热主要分布在我国的东北地区、俄罗斯的远东地区以及日本部分地区,在这些地区,从病人和不同种类的蜱中都分离到了黑龙江立克次体,说明该病为该地区重要的新发传染病。本研究通过空斑纯化获得黑龙江立克次体的单克隆菌株,使用Vero细胞扩大培养立克次体,通过泛影葡胺密度梯度离心纯化菌体,通过实验感染BALB/c小鼠,研究不同时相小鼠血液以及主要器官的立克次体的载量、病理损伤以及细胞因子水平,建立了黑龙江立克次体的BALB/c小鼠感染模型,为进一步揭示黑龙江立克次体的致病机制奠定了基础。将冷冻保藏的黑龙江立克次体接种鸡胚进行复苏,并通过空斑法对黑龙江立克次体进行克隆。随后,将克隆的立克次体在Vero细胞中大量繁殖和采用泛影葡胺不连续密度梯度离心法从宿主细胞中分离纯化立克次体,获得高纯度的活立克次体供研究使用。采用1×105个活菌眼框静脉丛注射感染5周龄雌性BALB/c小鼠,同时设置两个对照组,分别注射等量的热灭活菌体和磷酸盐缓冲液。在感染后的第1、3、6、9天,每组随机取出5只小鼠采血后处死,取肝、脾、肺、脑等组织样本。从小鼠的组织和血液样本中提取DNA,使用实时荧光定量PCR法检测立克次体拷贝数;从小鼠组织中提取组织RNA,对RNA进行逆转录获得cDNA,采用实时荧光定量PCR检测细胞因子表达水平。制备立克次体抗原片对小鼠血清做间接免疫荧光试验(IFA),检测血清中特异抗体水平。活菌感染组BALB/c小鼠在注射后第2天出现了活动减少、耸毛等症状,感染后第6天又恢复到了正常状态,而注射了灭活菌体和磷酸盐缓冲液的小鼠在试验期间并没有任何病理表现。活菌感染组小鼠感染后第1天血液和器官中可以检测得到立克次体,第3天菌体量显著增加,第6天达到了高峰,第9天又显著下降,并降到低于第1天的水平。组织病理学分析发现活菌感染小鼠的肝、肺和脑组织在感染后第1、3天没有出现病变,感染后第6天出现了明显病变,到第9天组织病变基本消失。灭活菌对照组小鼠组织在各个时相均没有出现病变。黑龙江立克次体感染BALB/c小鼠后可以很快进入血液并传播到全身,导致全身性的血管内皮细胞感染,进而导致了立克次体血症;立克次体感染后能够很快扩散到全身主要器官,引起其组织损伤。荧光定量PCR方法检测小鼠组织中IFN-γ, TNF-α和RANTES的转录水平,发现活菌感染小鼠的肝、肺、脑组织的3种细胞因子的转录水平均在感染后第3天显著增加,第6天显著下降。脾组织中3种细胞因子转录水平也有同样的趋势,但变化不显著。灭活小鼠组织的3种细胞因子转录水平没有显著变化。感染后第3天小鼠主要器官的IFN-γ、TNF-α和RANTES的表达均显著上调,说明小鼠机体启动天然免疫应答并启动杀立克次体作用。间接免疫荧光检测发现活菌感染小鼠在感染后第7天检测到特异IgG抗体,第21天抗体滴度显著增高,达到1:1600;灭活菌作用小鼠的血清中检测到特异IgG抗体,但其水平显著低于活菌感染小鼠。感染后期高水平的特异性抗体产生与小鼠立克次体感染水平显著下降密切相关。本研究证明了黑龙江立克次体能够有效感染BALB/c小鼠,引起小鼠播散性感染和多器官炎性损伤,为进一步研究该病原体的致病与免疫机制提供了一个良好的动物模型。

全文目录

缩略词表  6-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-13
第一章黑龙江立克次体的培养与纯化  13-26
  1 材料  13-15
    1.1 菌株和鸡胚  13
    1.2 主要试剂  13-14
    1.3 主要仪器  14
    1.4 主要试剂的配制  14-15
  2 方法  15-20
    2.1 菌种复苏  15
    2.2 Gimenez 染色法鉴定立克次体  15-16
    2.3 间接免疫荧鉴定立克次体  16
    2.4 空斑克隆黑龙江立克次体  16
    2.5 黑龙江立克次体的分子鉴定  16-17
    2.6 Vero 细胞的培养  17
    2.7 立克次体单克隆菌株扩大培养  17-18
    2.8 泛影葡胺不连续密度梯度离心纯化黑龙江立克次体  18
    2.9 实时荧光定量检测黑龙江立克次体  18-19
    2.10 黑龙江立克次体活力测定  19-20
  3 结果  20-25
    3.1 黑龙江立克次体染色结果  20-21
    3.2 空斑克隆黑龙江立克次体  21
    3.3 黑龙江立克次体的鉴定  21
    3.4 黑龙江立克次体在Vero 细胞上培养  21-22
    3.5 泛影葡胺不连续密度梯度法纯化黑龙江立克次体  22-23
    3.6 实时荧光定量检测黑龙江立克次体  23-24
    3.7 黑龙江立克次体活力测定结果  24-25
  4 讨论  25-26
第二章黑龙江立克次体感染BALB/c 小鼠的研究  26-36
  1 材料  26-27
    1.1 主要试剂  26-27
    1.2 主要仪器  27
  2 方法  27-30
    2.1 实验感染BALB/c 小鼠  27
    2.2 实验样品取材  27
    2.3 组织总DNA 的提取  27-28
    2.4 组织总RNA 的提取与逆转录  28
    2.5 组织病理观察  28
    2.6 荧光定量PCR 检测小鼠样本中立克次体  28-29
    2.7 荧光定量PCR 检测小鼠组织中IFN-γ、TNF-α、RANTES 的转录水平  29
    2.8 间接免疫荧光检测小鼠血清特异性抗体水平  29
    2.9 统计方法  29-30
  3 结果  30-33
    3.1 病理损伤分析  30-31
    3.2 小鼠血液和器官中立克次体载量分析  31
    3.3 荧光定量PCR 分析小鼠组织中IFN-γ、TNF-α、RANTES 的转录水平  31-33
    3.4 间接免疫荧光分析小鼠血清特异性抗体水平  33
  4 讨论  33-36
结论  36-37
参考文献  37-41
综述  41-48
  参考文献  44-48
代表性论著  48-53
个人简历  53-55
致谢  55

黑龙江立克次体感染BALB/c小鼠的致病性研究

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