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NMDAR SNP的发掘及其与微波辐射致脑损伤相关性的探索研究

作　者: 田大为
导　师: 胡向军
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 微波辐射脑损伤单核苷酸多态性 NR1 NR2B 大鼠
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的意义:随着电子电气设备的广泛应用,人们对微波的生物效应问题愈发重视,中枢神经系统是微波辐射敏感的靶器官之一,流行病学调查显示,微波辐射可引起疲劳、头痛、激动、多梦、记忆力下降等症状。因此,寻找微波辐射损伤敏感的预测和监测指标对于微波辐射接触人群的防诊治极其重要。微波辐射参数以及影响的环境复杂多样,微波暴露人群个体敏感性各有差异,微波辐射人群脑结构和功能异常的发生风险及其与机体的遗传因素之间的关系需要关注。本研究拟着眼于微波辐射对脑组织的损伤,通过基因多态性研究来寻找预测微波辐射致脑损伤的重要指标。NMDA受体是中枢神经系统最重要的兴奋性氨基酸受体之一,微波辐射可引起其重要受体NR1、NR2B活性、数量及其基因和蛋白表达的改变,进而影响学习记忆等脑的重要功能。因此,研究NR1及NR2B基因是否存在多态性,及其与辐射致脑组织结构和功能改变是否存在相关性,对于寻找与微波辐射致脑损伤发生密切相关的敏感预测和监测指标,具有极其重要的现实意义。材料和方法:采用生物信息学分析NR1、NR2B基因可能存在SNP的区域,采用快速采血-全自动DNA提取-多重PCR扩增-三引物拼接测序的发掘方法对军事医学科学院动物中心15只二级雄性Wistar大鼠NR1、NR2B基因10个候选区域进行SNP的初步发掘。提取96只三个动物中心四种品系的二级雄性大鼠全血DNA,PCR扩增NR1、NR2B基因核心启动子区序列和NCBI-SNP库已报道的SNP所在区域序列,结合DNA测序与酶切分型方法进行SNP筛查和验证,并对发掘的SNP进行基因分型。采用30mW/cm2微波辐射48只三个动物中心两种品系大鼠,于辐射后7d活杀取材,海马组织提取DNA,采用DNA测序、酶切分型、HE染色、神经递质检测、Western Blot和图像分析等多种技术,研究微波辐射大鼠后发掘出的SNP所在区域DNA序列的改变,以及不同品系、不同基因型大鼠在辐射后海马功能、组织形态结构、NR2B蛋白表达的变化。结果:(1)不同动物中心(北京动物所、维通利华和军事医学科学院)的Wistar大鼠和SD大鼠NR2B核心启动子区705bp中发现1个SNP位点,为-217位C/T多态。(2)-217C/T不同的等位基因所在序列的结合位点不同,C等位含3个Hb、1个HSF和1个C-ETs-转录结合元件,T等位含4个Hb和1个HSF转录结合元件。(3)30mW/cm2微波辐射7d后大鼠SNP所在DNA序列与辐射前序列一致。(4)30mW/cm2微波辐射Wistar大鼠后7d,与假辐射组相比,辐射组CC型海马Asp、GABA含量增加(p<0.05),辐射组TT型Asp含量明显增加(p<0.01);与CC型相比较,TT型Asp含量增加(p<0.05);30mW/cm2辐射SD大鼠后7d,与假辐射组相比,辐射组CC型Gly含量增加(p<0.05),Asp、GABA含量明显增加(p<0.01),辐射组CT型Glu含量增加(p<0.05),Asp、Gly和GABA含量明显增加(p<0.01),辐射组TT型Glu和GABA含量增加(p<0.05),Asp和Gly含量明显增加(p<0.01);与CC型相比较,TT型GABA含量增加(p<0.05)。(5)假辐射组大鼠海马组织呈正常形态结构,神经元丰富且轮廓清晰,多呈圆形,细胞核大而圆且着色较浅,位于细胞中央。30mW/cm2辐射后7d不同品系不同基因型大鼠海马神经元呈现不同程度的变性、坏死,主要表现为锥体细胞和颗粒细胞均见核固缩深染、呈不规则深蓝色质块,胞体皱缩呈梭形;间质毛细血管充血扩张,血管周间隙增宽。齿状回及CA3区损伤较重。Wistar和SD大鼠各基因型损伤程度与假辐射组相比,有差异性表现(P<0.05),但各品系内不同基因型之间损伤无明显差异。(6)30mW/cm2辐射后7d,相对于假辐射组, Wistar大鼠辐射组CC型NR2B蛋白表达明显上调(p<0.01),CT型和TT型NR2B蛋白表达下调(p<0.05);相对于假辐射组,SD大鼠辐射组CC型NR2B蛋白表达明显上调(p<0.01),CT型NR2B蛋白表达明显下调(p<0.01)。(7)不同动物中心的四种品系大鼠NR1启动子区、NR2B上游启动子区以及SNP库报道的4个位点中没有找到SNP。结论:(1)在不同动物中心不同品系(Wistar和SD)大鼠NR2B核心启动子区内首次发现-217C/T多态(可分为三种基因型,CC、CT、TT);该位点:1)不同的等位基因所在序列的结合位点是不同的,提示该SNP可能与NR2B的基因转录、翻译、表达和调控以及信号通路的改变密切相关。2)微波辐射不会引起SNP所在区域DNA序列的改变,辐射后该位点稳定存在。(2)30mW/cm2微波辐射可引起两个品系、三种基因型的大鼠:1)海马功能异常,表现为氨基酸类神经递质代谢紊乱;同一种系(Wistar大鼠)不同的基因型以及不同种系间(Wistar大鼠和SD大鼠)氨基酸递质的改变均有不同。2)海马组织结构损伤,其损伤特点基本相似,均表现为神经元胞核固缩、胞体皱缩,间质毛细血管充血扩张,血管周间隙增宽。3)海马NR2B蛋白表达异常,CC型NR2B蛋白表达增加、CT型NR2B蛋白表达降低。(3)微波辐射后CC型NR2B蛋白表达和氨基酸神经递质的改变可能参与了辐射后脑损伤和修复的过程,且以保护作用为主,CT型和TT型可能主要参与了辐射损伤的过程,提示遗传因素可能与微波辐射致脑功能异常的敏感性密切相关。

全文目录

缩略词表  5-7
摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-17
  参考文献  15-17
第一部分 NR1、NR2B 基因及其启动子区域多态性位点的生物信息学分析以及 SNP 的发掘研究  17-31
  材料与方法  17-25
  结果  25-27
  讨论  27-30
  结论  30-31
第二部分不同动物中心不同品系大鼠辐射模型的建立以及 NRNR2B 基因核心启动子区 SNP 的发掘研究  31-46
  材料与方法  31-36
  结果  36-41
  讨论  41-45
  结论  45-46
第三部分 NR2B 基因核心启动子区多态性与微波辐射致脑损伤相关性的探索研究  46-65
  材料与方法  46-54
  结果  54-61
  讨论  61-64
  结论  64-65
全文结论  65-66
参考文献  66-70
文献综述  70-78
  参考文献  76-78
个人简历  78-79
攻读硕士学位期间发表论文、承担课题和获得奖励一览表  79-80
致谢  80-83

NMDAR SNP的发掘及其与微波辐射致脑损伤相关性的探索研究

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