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EGCG负载对血小板生物学特性及功能的影响

作　者: 房磊
导　师: 韩颖; 王捷熙
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理与病理生理学
关键词: 表没食子儿茶素没食子酸酯负载液血小板细胞凋亡
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

EGCG是一种重要的水溶性茶多酚类化合物。近年来,相关的研究和调查都已经证实服用含较高浓度EGCG的绿茶及相关提取物可以对预防癌症和血栓性心血管疾病有显著效果,对服用EGCG的志愿者和试验动物的抽样研究发现,EGCG能够通过抑制血小板的聚集活性,降低服用者的缺血性心脑血管疾病的发生率,但是EGCG抗血小板聚集作用的具体机制尚不明了。有文献报道EGCG具有下调癌细胞中Bcl-xl蛋白表达的作用。澳大利亚科学家Mason在研究血小板程序性凋亡中也发现,Bcl-xl蛋白是影响血小板寿命的关键因素,影响Bcl-xl的因子能显著改变血小板的生理生化功能和寿命。因此,我们推测,EGCG对血小板的影响与其引发Bcl-xl蛋白的降解有关。鉴于此,本研究依据血小板内吞作用,将EGCG负载到血小板内,观察分析EGCG对血小板生物学特性的影响,并研究EGCG对血小板中Bcl-xl蛋白的作用,为进一步揭示EGCG的抗血栓作用提供理论依据。首先进行基础负载液筛选研究,分析了负载液A、负载液B、负载液C、血浆、PBS、生理盐水和ACD液对血小板的影响。实验结果表明,1、上述7种负载液与血小板共孵育后,负载液B组、C组和血浆组的血小板回收率分别为(82.40±1.35)%、(80.14±0.46)%和(81.89±0.91)%,明显优于其他组别(p<0.05)。2、血小板与负载液共孵育后,对血小板的ADP诱导的聚集活性有影响,其中负载液C、血浆和ACD组的聚集活性分别为(74.76±5.98)%、(74.19±9.44)%和(74.00±1.51)%;均高于其它负载液组。而7种负载液对THR诱导的血小板聚集活性均无影响,各组的聚集活性均在93%以上。3、血小板与负载液共孵育后,ACD负载液组有82.3%的血小板发生早期凋亡,其余6种负载液组的血小板凋亡率<5%。在EGCG吸收效率的研究中发现,负载液C吸收效率为(1.10±0.11)mM,明显高于其它各组。我们对血小板与负载液共孵育后的血小板回收率、聚集活性、早期凋亡和EGCG负载效率进行综合分析,确定负载液C为本研究的基础负载液。确定负载液C后,我们对负载条件进行了优化。对负载液C处理后血小板的各种指标的检测中表明,血小板在37℃时回收率和聚集活性能够保持较高水平,分别为(78.80±0.82)%和聚集活性(65.92±7.33)%;随后不同负载温度作用下血小板负载EGCG的检测中发现,37℃负载2h时,血小板负载EGCG量达到最高,1mM处理组为(0.23±0.03)mM;2mM处理组为(0.46±0.02)mM。在负载时间的筛选中,负载温度为37℃,负载时间为1.5h时其血小板回收率为(82.53±0.46)%,聚集活性为(64.44±3.14)%;1mM处理组中负载入血小板的EGCG为(0.22±0.21)mM;2mM处理组为(0.43±0.02)mM。当负载时间小于1.5h时负载效率随时间的增加而快速增强,超过1.5h后,负载入血小板中的EGCG的浓度增加开始放缓。综合考虑,我们最终选择37℃,1.5h作为负载条件。确定了负载体系和负载条件后,接下来我们进行EGCG负载后对血小板的理化功能、体外回收率和对EGCG吸收效率的研究。将血小板与含有不同浓度EGCG(浓度分别为:0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、20、30 mM)的负载液共孵育,通过比较回收率和聚集活性,将实验分为2.5、5、10mM负载液处理组和空白对照组,观察保存期内血小板回收率和聚集活性的变化。实验结果表明,负载液中EGCG浓度分别为2.5、5、10mM时,血小板内的EGCG浓度分别为0.40±0.12、1.05±0.15、1.69±0.11 mM。当负载液中EGCG浓度低于15 mM时,与血小板对EGCG的吸收效率呈正相关。检测血小板回收率时发现,2.5 mMEGCG组的回收率为(90.70±0.36)%,空白组为(99.36±1.12)%,提示EGCG负载后血小板回收率下降(p<0.05);比较而言, 5 mM EGCG组的回收率(63.27±2.47)%和10 mMEGCG组的回收率(52.20±2.03)%下降更为明显(p<0.01)。进一步研究发现,对照组的ADP和THR诱导的聚集活性分别为(91.88±21.87)%和(89.30±6.53)%,明显高于其它实验组(p<0.01),提示,血小板的ADP和THR诱导的聚集活性与负载液中EGCG浓度呈负相关。细胞凋亡检测结果表明,随着负载液EGCG浓度的升高,血小板的凋亡百分比增加,负载液中EGCG的浓度为10 mM时,有超过60%血小板发生早期凋亡。以上实验结果表明,EGCG负载后血小板生物学特性和功能发生变化,血小板回收率下降、细胞凋亡率增加和聚集活性减弱。有文献报道,EGCG在前列腺癌细胞和肝癌细胞的主要作用是通过下调Bcl-2家族中的Bcl-xl蛋白引发癌细胞的凋亡。存在于胞浆中的Bcl-xl蛋白已经被证实在血小板的凋亡通路中起到关键性的作用。因而我们推测负载EGCG后血小板生理指标的显著改变可能与EGCG促进了血小板内Bcl-xl蛋白的降解有关。我们在研究EGCG与血小板中Bcl-xl蛋白相互作用关系发现,EGCG负载后血小板总蛋白的含量与对照组相比,无显著差异(p>0.05)。但血小板中Bcl-xl蛋白含量下降,在2.5mM、5mM和10mM EGCG处理组中血小板内Bcl-xl蛋白浓度分别为:(3.08±0.05)ng/mL、(2.37±0.27)ng/mL和(1.88±0.08)ng/mL,均低于对照组(3.59±0.07)ng/mL,且随着负载液中EGCG浓度的增高,Bcl-xl蛋白含量下降。Western Blot的结果与Elisa检测结果相一致。免疫荧光的结果也显示, EGCG负载后血小板中的Bcl-xl蛋白表达量明显低于对照组,说明EGCG下调了血小板中Bcl-xl蛋白的含量。综上所述,本研究筛选出了基础负载液和EGCG负载液,优化出负载条件。证明了EGCG负载血小板后,对血小板的生理生化功能造成影响,抑制了血小板的聚集活性,并且这种作用与EGCG的负载量呈正相关。进一步的研究发现, EGCG可以降低血小板中Bcl-xl蛋白的表达量,导致了血小板的聚集活性下降,促进了血小板的凋亡。本研究结果为进一步揭示EGCG的抗血栓作用提供理论基础,同时为研发抗血小板、预防血栓性疾病的药物提供了新的思路。

全文目录

英文缩略词表  4-5
摘要  5-8
Abstract  8-12
前言  12-15
第一部分 EGCG负载血小板方法的建立  15-29
  1 实验材料  15-17
  2 实验方法  17-19
  3 实验结果  19-25
  4 讨论  25-29
第二部分 EGCG负载对血小板生物学特性及功能的影响  29-38
  1 实验材料  29-30
  2 实验方法  30-31
  3 实验结果  31-36
  4 讨论  36-38
第三部分EGCG对血小板功能影响的机制的初探  38-54
  1 实验材料  38-39
  2 实验方法  39-46
  3 实验结果  46-52
  4 讨论  52-54
总结  54-56
参考文献  56-60
文献综述  60-67
  参考文献  65-67
论著  67-78
个人简历  78-80
致谢  80

EGCG负载对血小板生物学特性及功能的影响

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