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水通道4在神经病理性疼痛中的作用及可能机制

作　者: 孙雅洁
导　师: 李锦
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 水通道4 神经病理性疼痛星形胶质细胞小胶质细胞前炎性细胞因子
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

国际疼痛研究协会将神经病理性疼痛定义为在外周或中枢水平由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛。神经病理性疼痛严重影响患者的生活质量，治疗困难，给社会带来巨大的卫生资源压力和沉重的经济负担。神经病理性疼痛的发病机制复杂，目前尚未完全阐明。近年来国内外对神经病理性疼痛的机制已进行了大量研究并取得了一定的进展。目前学术界普遍认为神经病理性疼痛的产生及维持涉及神经系统的可塑性，包括外周及中枢机制，但是确切机制尚未阐明。越来越多的证据表明，包括星形胶质细胞和小胶质细胞在内的脊髓胶质细胞在慢性疼痛特别是神经病理性疼痛的发生、发展、维持过程中发挥着重要的作用，因此研究和发现影响胶质细胞激活的分子对于解释神经病理性疼痛的生物学机制以及发现新的干预靶点和治疗措施具有十分重要的意义。水通道4（aquaporin4, AQP4）是参与水转运的水通道家族中的一员，是中枢神经系统表达最丰富的水通道。在脑内AQP4呈典型的极性分布，主要表达于星形胶质细胞与血管相连的终足上，同时在室管膜细胞和内皮细胞上也有表达；在神经元中几乎不表达；在静息态的小胶质细胞上不表达，激活态的小胶质细胞上是否表达尚存在争议。在脊髓中，AQP4主要分布于围绕兴奋性和抑制性突触结构的星形胶质细胞突起部位，提示其可能参与突触传递功能。AQP4在脊髓背角中的分布从浅层到深层逐渐降低，在背角浅层（I、II层）表达最高，提示可能与脊髓背角浅层的功能密切相关。文献调研显示，AQP4是星形胶质细胞上最重要的水通道，能够影响星形胶质细胞的细胞骨架结构和细胞间隙连接；能够调节星形胶质细胞的功能，影响星形胶质细胞的迁移、增殖以及瘢痕的形成。此外，AQP4与钾通道4.1（Kir4.1）和谷氨酸转运体1（glutamate transporter1, GLT1）共存于星形胶质细胞中，在功能上存在偶联，对于细胞外K+稳态的维持以及突触间隙谷氨酸的清除非常重要。AQP4还通过影响星形胶质细胞的功能来调节神经元的功能，包括调节神经元的兴奋性、多巴胺（dopamine，DA）、谷氨酸（glutamate，Glu）等神经递质的含量及释放和某些病理条件下神经元存活和神经再生，但详细机制有待进一步研究。近年来大量研究报道星形胶质细胞参与神经病理性疼痛。最近研究显示，损伤、缺血诱发的脑内AQP4表达上调与星形胶质细胞的特异性标志物胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表达上调相平行，而下调AQP4表达则影响碱性成纤维细胞生长因子刺激的星形胶质细胞的增殖；AQP4基因敲除能够降低脑内注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）引起的神经炎症，也能够降低培养的星形胶质细胞中LPS刺激的前炎性细胞因子的释放。以上研究提示，AQP4可能与星形胶质细胞的功能密切相关，但是AQP4是否参与神经病理性疼痛目前尚未见报道。因此，本课题的目的是研究AQP4在神经病理性疼痛中的作用及可能机制。本课题的研究内容主要包括以下三部分：第一部分，在小鼠急性疼痛模型和大鼠神经病理性疼痛模型中给予AQP4非选择性抑制剂乙酰唑胺（acetazolamide,AZA），初步研究AQP4在急性疼痛和神经病理性疼痛中的作用。结合本课题组在AQP4基因敲除动物中的研究结果，在明确了AQP4在神经病理性疼痛中的作用后，第二部分，应用野生型和AQP4基因敲除小鼠构建坐骨神经分支损伤模型(spared nerve injury, SNI）模型，研究神经病理性疼痛发生、发展进程中脊髓AQP4表达的时程特征及其与星形胶质细胞和小胶质细胞激活的关系。明确AQP4与胶质细胞激活的关系后，第三部分研究哪些刺激胶质细胞激活的因素依赖于AQP4，即在细胞水平从胶质细胞激活方面探讨AQP4影响了哪些刺激胶质细胞激活的因素。通过以上研究，探讨AQP4参与神经病理性疼痛的作用机制。具体研究结果如下：一、AQP4非选择性抑制剂乙酰唑胺对急性疼痛和神经病理性疼痛的作用：AQP4非选择性抑制剂AZA对热刺激（热辐射甩尾和热板模型）诱发的小鼠急性疼痛无显著影响，但是AZA可剂量依赖的减轻大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤（chronic constriction injury, CCI）模型机械刺激痛觉超敏。本课题组尚未发表的实验结果表明AQP4基因敲除对热刺激（热板和热辐射甩尾模型）、化学刺激（福尔马林和辣椒素致痛模型）和机械刺激（von Frey hair模型）诱发的急性疼痛均无影响，但是能显著减轻神经病理性疼痛诱发的机械刺激痛觉超敏。这些实验结果提示AQP4不影响急性疼痛，可能参与神经病理性疼痛。二、在神经病理性疼痛中AQP4表达的时程特征及其与胶质细胞激活的关系：行为学测试结果显示，在小鼠SNI模型中，从术后1d到术后28d，AQP4基因敲除（knockout, KO）小鼠与野生型（wild-type, WT）小鼠相比机械刺激痛觉超敏的程度显著减轻，提示AQP4在神经病理性疼痛中发挥了作用。在此模型中，我们研究了脊髓中的AQP4在神经病理性疼痛中表达的时程特征及其与胶质细胞激活的关系。蛋白免疫印迹分析结果显示，在WT小鼠中，与假手术组相比，SNI手术组小鼠脊髓（L4-L6节段）中AQP4的表达在术后1d和3d无显著变化，而在术后7d开始出现显著升高，该现象至少持续至术后28d；GFAP（星形胶质细胞的特异性标志物，其表达上调反映了星形胶质细胞的激活）的表达和表达的时程改变与AQP4完全一致；簇分化抗原11b（Cluster differentiation antigen11b, CD11b,小胶质细胞的标志物，其表达上调反映了小胶质细胞的激活）的表达则在术后1d就出现明显升高并持续至术后7d，之后开始降低，术后28d时已恢复至正常水平。在AQP4KO小鼠中，与假手术组相比，SNI手术组小鼠脊髓中GFAP的表达在术后1d到术后28d均未出现明显改变；CD11b的表达在术后1d和3d未出现显著性升高。术后7d开始降低，术后14d时已恢复至正常水平。这些结果提示，在神经病理性疼痛早期，AQP4的表达没有改变，星形胶质细胞也没有激活，但此时小胶质细胞已经激活；而在神经病理性疼痛中晚期，AQP4表达增强，此时星形胶质细胞也处于激活状态，但小胶质细胞的激活开始降低并恢复至正常水平。以上结果说明星形胶质细胞的激活和AQP4的表达升高具有相关性，而小胶质细胞的激活和AQP4的表达升高的相关性还有待进一步研究。因此，AQP4基因敲除减轻神经病理性疼痛的机制可能与其抑制脊髓中星形胶质细胞的激活有关。在神经病理性疼痛中，激活的星形胶质细胞和小胶质细胞均能够释放前炎性细胞因子，如白介素1beta（interleukin-1β, IL-1β）、白介素6（interleukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子alpha（tumor necrosis factor-, TNF-），这些因子反映了胶质细胞激活后的功能变化。在WT小鼠中，与假手术组相比，SNI手术组小鼠脊髓（L4-L6节段）中IL-1β、IL-6和TNF-的含量在术后1、3、7、14和28d均显著升高，与胶质细胞的激活相一致；在AQP4KO小鼠中，与假手术组相比，SNI手术组小鼠脊髓中上述3种因子的含量在术后1d和3d未出现显著性升高，从术后7d开始3种因子的含量恢复至正常水平。结果提示，在神经病理性疼痛早期，3种因子的来源主要是激活的小胶质细胞；而在神经病理性疼痛中晚期，3种因子的来源主要是激活的星形胶质细胞。因此，在神经病理性疼痛中晚期，AQP4基因敲除能够降低脊髓中前炎性细胞因子的含量。综上所述，本部分研究发现AQP4基因敲除减轻神经病理性疼痛的机制可能与其抑制脊髓星形胶质细胞的激活、降低前炎性细胞因子的含量有关；与小胶质细胞的关系有待进一步有研究。三、AQP4对胶质细胞激活的调节及机制：本课题的第二部分在整体水平上观察到了AQP4与星形胶质细胞激活的关系，而AQP4又表达于星形胶质细胞上，那么AQP4是否直接影响了星形胶质细胞的激活？因此本部分研究用体外实验来回答这个问题。神经病理性疼痛中（如SNI模型），前炎性细胞因子和致痛递质是两个很重要的引起胶质细胞激活的刺激因素，在本部分的研究中，用LPS刺激胶质细胞模拟前炎性细胞因子引起的胶质细胞的激活，用谷氨酸（glutamicacid, Glu）刺激胶质细胞是致痛递质导致胶质细胞激活的刺激因素。在原代培养的星形胶质细胞模型上，通过免疫荧光实验发现LPS（100ng/ml）能够激活体外培养的大鼠乳鼠脊髓星形胶质细胞；而AQP4非选择性抑制剂AZA（0.1μM、0.3μM、1μM、3μM和10μM）可以剂量依赖的抑制LPS诱导的星形胶质细胞的激活。此外，LPS（100ng/ml）可以引起AQP4表达阳性的WT乳鼠脊髓星形胶质细胞的激活，而不引起AQP4表达阴性的KO乳鼠脊髓星形胶质细胞的激活。这些实验结果说明LPS诱导的星形胶质细胞的激活依赖于AQP4的存在。同时还发现Glu（10μM、100μM和1mM）能够激活体外培养的大鼠乳鼠脊髓星形胶质细胞；而AZA（10μM）可以抑制上述3个浓度的Glu诱导的星形胶质细胞的激活。此外，Glu（1mM）可以引起AQP4表达阳性的WT乳鼠脊髓星形胶质细胞的激活，而不引起AQP4表达阴性的KO乳鼠脊髓星形胶质细胞的激活。这些实验结果表明Glu诱导的星形胶质细胞的激活依赖于AQP4的存在。因此，体外实验直接证实了AQP4的存在是星形胶质细胞激活所必需的。因此，本论文研究首次发现，AQP4不影响急性疼痛，但参与神经病理性疼痛；其可能机制是通过直接影响脊髓星形胶质细胞的激活以及前炎性细胞因子的释放实现的。

全文目录

缩略词表  6-9
摘要  9-13
Abstract  13-18
前言  18-30
第一章水通道 4 非选择性抑制剂乙酰唑胺对急性疼痛和神经病理性疼痛的作用  30-36
  1. 研究背景  30
  2. 材料与方法  30-32
    2.1 实验动物  30
    2.2 主要试剂  30
    2.3 主要仪器  30-31
    2.4 实验方法  31-32
    2.5 统计分析  32
  3. 结果  32-34
    3.1 乙酰唑胺对热辐射致小鼠急性疼痛的作用  33
    3.2 乙酰唑胺对热板致小鼠急性疼痛的作用  33-34
    3.3 乙酰唑胺对大鼠 CCI 模型致神经病理性疼痛的作用  34
  4. 讨论  34-35
  5. 小结  35-36
第二章神经病理性疼痛中水通道 4 表达的时程特征及其与胶质细胞激活的关系  36-52
  1. 研究背景  36-37
  2. 材料与方法  37-41
    2.1 实验动物  37
    2.2 主要试剂  37-38
    2.3 主要仪器  38
    2.4 实验方法  38-40
    2.5 统计分析  40-41
  3. 结果  41-48
    3.1 小鼠 SNI 模型不同时点脊髓中 AQP4、GFAP 以及 CD11b 表达分析  41-45
    3.2 小鼠 SNI 模型不同时点脊髓中前炎性细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF- 含量变化分析  45-48
  4. 讨论  48-50
  5. 小结  50-52
第三章水通道 4 对胶质细胞激活的调节及机制  52-62
  1. 研究背景  52
  2. 材料与方法  52-55
    2.1 实验动物  52
    2.2 主要试剂  52-53
    2.3 主要仪器  53
    2.4 实验方法  53-55
  3. 结果  55-60
    3.1 AQP4 对 LPS 诱导的星形胶质细胞的激活的影响  55-58
    3.2 AQP4 对 Glu 诱导的星形胶质细胞的激活的影响  58-60
  4. 讨论  60-61
  5. 小结  61-62
结论  62-63
参考文献  63-70
综述  70-81
  参考文献  77-81
在读期间发表的代表性论文  81-103
个人简历  103-104
致谢  104

水通道4在神经病理性疼痛中的作用及可能机制

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