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肝细胞微囊化制备与胚胎干细胞发育调控研究

作　者: 滕越
导　师: 裴雪涛
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 胎肝基质细胞肝细胞胚胎干细胞定型内胚层 miRNA 蛋白质组
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目前,原位肝移植OLT (orthotopic liver transplantation, OLT)无疑是治疗终末期肝病最为有效的方法。然而,供肝严重短缺、急慢性排斥反应的存在以及长期应用免疫抑制剂所带来的毒副作用是肝移植所面临的三大问题。肝细胞移植(HCT)和生物人工肝(bioartificial liver, BAL)作为一种有望部分替代原位肝移植的崭新而有效的方法受到广泛关注,以干细胞为种子细胞的细胞治疗和组织再生也显示出越来越广阔的临床应用前景。因此,基于干细胞生物学基础上的肝脏再生为人们突破终末期肝病治疗所面临困境带来希望。本研究主要开展基于干细胞技术的肝脏损伤再生相关研究：研制适用于生物人工肝或直接进行体内移植的微囊化肝细胞；探讨人胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化的调控机制,为进一步优化干细胞向肝细胞的诱导体系以及提高诱导分化效率打下基础。本研究主要包括两部分内容：一、微囊化混合共培养大鼠肝细胞与转bFGF胎肝基质细胞治疗小鼠急性肝衰竭的实验性研究本部分实验通过体外平面和微囊化共培养转bFGF的胎肝基质细胞和大鼠原代肝细胞,证明转bFGF的胎肝基质细胞有助于成熟肝细胞生物学功能发挥及寿命维持,并在传统的微囊化三维培养肝细胞的基础上,将对肝细胞的增殖和寿命维持起支持作用的胎肝基质细胞和转bFGF的胎肝基质细胞与大鼠原代肝细胞混合微囊化,发现微囊化混合培养转bFGF的胎肝基质细胞能够提高和维持原代肝细胞的各项功能指标。随后展开的体内移植试验,将其移植入急性肝衰竭小鼠模型的腹腔内,观察微囊化混合肝细胞对肝衰竭小鼠肝功能恢复所起的作用,以及移植后的肝衰竭小鼠的存活率及肝组织学的改变。通过实验发现转bFGF胎肝基质细胞的存在能通过维持移植的微囊内肝细胞的功能,明显促进肝衰竭小鼠的肝再生,从而提高了肝衰竭小鼠的存活率,并有利于小鼠的长期存活。本实验为肝细胞移植及生物人工肝等提供新的途径,为生物人工肝最终能应用终末期肝病的治疗打下基础。但是目前肝细胞的数量和质量一直是生物人工肝临床应用中难以突破的核心问题。干细胞本身所具有的特性可以使其在体外扩增培养并定向诱导分化为人们所需的各种组织细胞,从而有望为生物人工肝提供足够数量的肝细胞来源。二、人胚胎干细胞向定型内胚层分化的调控机制研究干细胞向肝脏细胞的诱导分化中存在着一系列的问题亟待解决,其中最为重要的问题是关于胚胎干细胞或者诱导性多能干细胞如何诱导分化为内胚层细胞,尤其是肝细胞的机制目前还远不清楚,这极大限制了干细胞向肝脏细胞诱导分化的效率。本部分实验,我们建立在无血清无滋养层的体系下诱导人胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化的模型。在此基础上,通过miRNA生物芯片比较筛选人胚胎干细胞向定型内胚层分化前后表达差异的miRNA,以期得到参与定型内胚层分化的候选miRNA。通过生物信息学分析表达差异miRNA的靶基因,发现CTGF可能在胚胎干细胞自我维持和分化过程中起重要的作用。与此同时,结合蛋白质组学技术,通过2D-DIGE和质谱鉴别大规模筛选在该阶段表达量发生明显变化的蛋白质。蛋白质组学结果发现人胚胎干细胞向定型内胚层分化过程中潜在的标志和可能在定型内胚层分化和发育过程中起重要作用的蛋白质。这些结果进一步阐述了人胚胎干细胞向定型内胚层分化过程中的分子机制。综上,以上研究证明了微囊化混合共培养大鼠肝细胞与转bFGF胎肝基质细胞能够明显促进肝衰竭小鼠的肝再生,有助于为肝衰竭等终末期肝病的治疗提供新的手段。与此同时,本研究还探讨人胚胎干细胞向定向内胚层细胞的分化机制,为最终建立高效的诱导分化策略奠定基础。

全文目录

缩略词表  6-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
前言  12-18
第一章微囊化混合共培养大鼠肝细胞与转bFGF胎肝基质细胞治疗小鼠急性肝衰竭的实验研究  18-34
  第一节体外平面和微囊化共培养大鼠原代肝细胞与转bFGF胎肝基质细胞  20-26
    材料与方法  20-22
    结果  22-26
  第二节体内移植微囊化混合肝细胞对肝衰竭小鼠生存和肝功能的影响  26-31
    材料和方法  26-28
    结果  28-31
  讨论  31-34
第二章人胚胎干细胞向定型内胚层分化的调控机制研究  34-86
  第一节人胚胎干细胞体外培养体系的建立  37-45
    材料与方法  37-42
    结果  42-45
  第二节体外诱导人胚胎干细胞向定型内胚层分化模型的建立  45-52
    材料与方法  45-49
    结果  49-52
  第三节芯片筛选人胚胎干细胞向定型内胚层分化过程中差异表达的miRNA  52-60
    材料与方法  52-54
    结果  54-60
  第四节 CTGF基因在人胚胎干细胞中的作用及机制研究  60-73
    材料与方法  60-67
    结果  67-73
  第五节蛋白质组学分析人胚胎干细胞向定型内胚层分化过程中表达变化的蛋白质  73-83
    材料与方法  73-77
    结果  77-83
  讨论  83-86
结论  86-88
参考文献  88-94
附录  94-106
  主要仪器设备  94-96
  主要试剂  96-98
  人胚胎干细胞向定型内胚层分化过程中差异表达的miRNA  98-102
  人胚胎干细胞向定型内胚层分化过程中表达变化的蛋白质  102-106
与学位论文相关的该研究领域文献综述(全文)  106-112
在学期间发表的代表性论著(全文)  112-122
个人简历  122-123
致谢  123

肝细胞微囊化制备与胚胎干细胞发育调控研究

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