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人类胚胎干细胞中SOX2基因相关的保守（表观）遗传调控网络初探

作　者: 田靖
导　师: 陈惠鹏; 赵志虎
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 人类胚胎干细胞 SOX2基因保守序列基因调控网络染色体相互作用
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

胚胎学研究显示,在鱼类、鸟类、两栖类、哺乳类等脊椎动物的胚胎发育早期共同具有一段形态上非常类似的时期,即种系特征发育(phylotypic)阶段。科学家们普遍认为,基因的表达调控决定着生物的性状,追溯其外观相似的生物本质,发现脊椎动物胚胎早期发育相关的蛋白往往直系同源、其编码蛋白的基因也具有较高的保守性,并且这些发育相关基因侧翼的调控序列也高度保守。基于对生物表型和本质的认识,我们提出这样一个设想,即脊椎动物的早期发育(种系特征发育阶段)模式受到了某种保守性的(表观)遗传调控网络的控制。我们将在生物演化中具有高度保守性的调控序列作为研究这一保守的遗传调控网络的切入点。超保守元件(UCE)在人类基因组中成簇分布,位于关键性发育基因的侧翼,部分UCE已被验证在小鼠胚胎发育的特定组织中具有增强子活性。我们推测,这些保守的调控元件因为功能上的相关性或者相似性而发生相互作用,形成保守的(表观)遗传调控网络。加之对细胞核区隔化结构及染色体空间结构或位置对基因调控产生的影响等方面认识的逐步深入,我们推测,保守的(表观)遗传调控网络中的相关染色体很可能在细胞核空间发挥相互作用,并可能通过对染色体三维空间的相互作用进行捕获的方法将此网络抽提出来。于是,本研究基于对细胞核染色体空间结构的解析,挖掘并抽提这一保守的遗传或表观遗传调控网络,以加深对基因调控和生物演化发育机制的认识。人类胚胎干细胞由于其分化的多潜能性,成为研究人类胚胎发育的良好模型。近年来的研究发现了胚胎干细胞中具有的独特基因表达模式:发育相关基因在胚胎干细胞中通常处于准备(poised)的状态,当细胞发生分化时,特异基因可以迅速启动表达,决定细胞向不同组织器官分化的命运。同时,人类胚胎干细胞中还发现了一类成年特异组织中不具备的增强子元件,即准备型(poised)增强子元件(II类增强子),它们也与胚胎的早期发育密切相关。可见,胚胎干细胞中可能蕴藏着生物早期胚胎的发育模式,这些特点为利用人类胚胎干细胞模拟人类胚胎发育的研究提供了依据。SOX2是胚胎干细胞中一个重要的转录因子,在胚胎干细胞多潜能性和未分化状态维持中发挥着重要的功能。本研究从SOX2基因及其保守调控序列(SOX2 Bait)出发,尝试探讨SOX2基因相关的染色体内部相互作用及染色体之间的相互作用与人类胚胎干细胞多潜能性间的联系,为寻找胚胎干细胞多潜能相关保守(表观)遗传调控网络提供了线索。本研究从以下几个方面进行了探讨:建立了稳定的人类胚胎干细胞大量培养方法和体系,通过优化培养条件及机械传代和胰酶消化传代相结合的方法,在较短时间内获得了质量稳定的足够细胞,为后续实验提供了细胞材料;摸索了人类胚胎干细胞自主分化为EB细胞及定向诱导分化为神经前体细胞(NPC)的实验方法并获得成功;关注人类胚胎干细胞向EB细胞分化过程中多潜能及分化相关基因的表达情况变化,发现了人类胚胎干细胞系H9在体外培养中的细胞异质性现象。利用4C方法在全基因组范围内筛选与SOX2 Bait相互作用的染色体片段。首先,通过体外构建质粒(pDNA)、模拟4C样品的方法建立了4C-克隆筛选方法的质量控制标准。针对以SOX2 Bait为诱饵片段的4C扩增体系进行了PCR扩增条件优化,初步验证了该方法的有效性和可行性,为4C-有限克隆筛选和4C-seq样品的制备提供了质量保证。利用4C-有限克隆筛选方法对人类胚胎干细胞4C样品(4C-DpnII)进行扩增和初步筛选,得到了SOX2基因座位内部的染色体相互作用片段。进一步利用3C方法检测了这些相互作用片段在人类胚胎干细胞向EB细胞分化过程中相互作用频率的改变,构建了SOX2基因局部染色体的三维构象变化模型,推测染色体空间结构改变与SOX2基因表达调控的关系。研究发现,已报道增强子SRR1、SRR2与启动子的相互作用随着基因表达调控的改变而变化,这两个增强子元件调控SOX2基因启动子的模式在hESC和EB两种不同类型细胞中具有显著差异。Region011区域在EB3d和EB20d细胞中被检测到与启动子区具有相互作用,并在293A细胞中用荧光素酶报告基因的方法验证了该区域的增强子活性,提示Region011有可能成为潜在的增强子元件,调控SOX2基因在分化的EB细胞中表达。接着,利用4C-seq技术对以SOX2 Bait为诱饵片段的4C样品(4C-DpnII)单轮PCR扩增产物(4C-Seq样品)进行了Solexa高通量测序。筛选测序结果,将有效序列与人类基因组序列进行比对后,共得到135个位于不同基因组位置的命中序列(或命中片段)。这些命中序列分布于基因组中绝大多数染色体上,约有四分之一具有较好的保守性,同时具有p300和Elk-1的转录因子的结合位点,具有成为潜在增强子序列的可能。通过对命中序列相关基因功能的聚类分析(GO注释),我们发现部分序列相关基因的功能与膜受体蛋白激酶活性、黄素单氧化酶活性、钙离子结合等相关,在细胞黏附、生长等生物学过程中有一定的富集。并且,一些基因还参与了肺及生殖器发育等生物学过程,可能与SOX2在肺癌、卵巢癌和乳腺癌中的重要功能有一定关联。其中16个基因与钙离子的结合功能相关,与报道的SOX2在前列腺癌中的致瘤和抗凋亡机制似乎也存在某种联系。可见,与SOX2 Bait相互作用的染色体片段在功能上可能与SOX2存在某种潜在联系,通过对这些相互作用的检测和功能分析,为抽提人类胚胎干细胞中SOX2基因相关保守(表观)遗传调控网络构建了初步的框架。利用3D-FISH实验从单细胞水平上检测并验证染色体之间的相互作用。将改进后的3D-FISH方法用于检测两个待测基因染色体间的相互距离分布,并与对照组的基因间距离分布进行统计学分析,比较其显著性差异,从而判定这两个待测基因染色体在空间上是否相关。我们利用该方法在未分化的hESC和诱导分化的NPC两种不同细胞类型中对4C-seq命中片段筛选到的4C-8/9(HMCN1基因内含子区)片段与SOX2 Bait(SOX2基因增强子)染色体间的相互作用进行了检测。结果证实,HMCN1与SOX2的相互作用是hESC特异的,并且在hESC向NPC的分化过程中该相互作用消失。HMCN1和SOX2基因不仅在生物学功能上均与眼睛的发育相关,而且通过对与SOX2 Bait发生相互作用的4C-8/9序列区域的组蛋白修饰情况的分析后发现,4C-8/9区域具有HMCN1基因相关的潜在增强子的染色体修饰特点,并且与SOX2基因增强子同属于人类胚胎干细胞中的II类准备(poised)型增强子,初步发现了人类胚胎干细胞中II类准备(poised)型增强子所在染色体在细胞核空间共定位的现象。实验结果提示我们,相互作用序列可能由于调控类型的相似性或者功能上的相关性而在细胞核空间相互靠近,为“功能相关或相近片段在细胞核空间相共定位”的实验假设提供了部分实验证据。最后,我们从机制和功能等方面进一步对细胞核中染色体片段空间共定位的现象进行了深入的讨论。利用3D-FISH方法,我们检测了位于hESC核心调控通路中3个多潜能性相关转录因子(Oct4、SOX2和Nanog)基因所在染色体的相对空间位置,发现Oct4和Nanog在空间上相互靠近;还检测了4个同时具有9个转录因子结合的保守序列片段的相对空间位置,发现R1和C4在细胞核中相互靠近。我们发现了处于同一调控通路的功能相关并相互协调基因间存在相互作用及调控机制相关的保守性序列也可能在空间上相互靠近,从染色体相互作用的生物学意义和机制等方面初步验证了“功能相关的保守序列在细胞核空间发生相互作用而形成网络”的实验假设。

全文目录

中文摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-16
第一章人类胚胎干细胞的培养和分化  16-27
  1 材料与方法  16-19
    1.1 材料和仪器  16-17
    1.2 方法  17-19
  2 结果与分析  19-25
    2.1 胰酶消化传代使hES 细胞在大规模培养过程中仍维持良好的形态  19-20
    2.2 hESC 在培养过程中维持多潜能性  20-21
    2.3 hESC 自主分化为EB 细胞  21-23
    2.4 hESC 定向诱导分化为神经前体细胞（NPC）  23-25
  3 讨论  25-26
    3.1 发现人类胚胎干细胞系H9 在体外培养中的异质性  25-26
    3.2 hESC 培养方法优化  26
  4 小结  26-27
第二章 4C-克隆筛选方法建立中的质量控制  27-36
  1 材料和方法  27-29
    1.1 材料  27-28
    1.2 方法  28-29
  2 结果与分析  29-33
    2.1 SOX2 Bait 的扩增和pMD18-T-SOX2-bait 载体构建  29-31
    2.2 PCR 条件的优化  31-32
    2.3 4C-克隆筛选方法的实例验证  32-33
  3 讨论  33-36
第三章有限4C-克隆筛选发现调节SOX2 基因表达潜在调控元件  36-54
  1 材料和方法  37-40
    1.1 材料  37-38
    1.2 方法  38-40
  2 实验结果  40-50
    2.1 SOX2 基因座位调控元件预测分析  40-41
    2.2 有限克隆筛选染色体内部相互作用以及3C 引物的设计  41-44
    2.3 3C 模板的质量控制以及实验条件的优化  44
    2.4 hESC 向EB 细胞分化中SOX2 表达阶段性改变  44-45
    2.5 Region1 为锚定序列相互作用验证  45
    2.6 Region2 为锚定区域相互作用验证  45-49
    2.7 Region011 可能具有远距离增强子活性  49-50
  3 讨论  50-52
    3.1 SOX2 基因的调控模式体现出细胞特异性的特点  50-52
    3.2 蛋白复合体可能介导了染色体特异的相互作用  52
    3.3 调控SOX2 基因表达的其他机制  52
  4 小结  52-54
第四章 4C-Seq 全基因组筛选与SOX2 相互作用的DNA 元件  54-64
  1 材料和方法  54-55
    1.1 材料  54
    1.2 方法  54-55
  2 实验结果  55-62
    2.1 SOX2 Bait（诱饵）片段的选择及其生物信息学分析  55-56
    2.2 4C-Seq 样品的制备  56-57
    2.3 4C-Seq 数据筛选与分析  57-62
  3 讨论  62-63
  4 小结  63-64
第五章 3D-DNA FISH 验证染色体间的相互作用  64-77
  1 材料和方法  64-65
    1.1 材料  64
    1.2 方法  64-65
  2 实验结果  65-74
    2.1 染色体间共定位的判定  65-66
    2.2 4C-seq 命中片段的相互作用验证  66-67
    2.3 SOX2 与HMCN1 基因的相互作用具有细胞特异性  67-69
    2.4 HMCN1 与SOX2 相互作用的生物学意义  69-71
    2.5 hESC 核心调控网络相关基因的空间分布  71
    2.6 hESC 中受到多个转录因子结合保守序列的空间分布  71-74
  3 讨论  74-75
    3.1 对3D-DNA FISH 方法的评价  74-75
    3.2 染色体在细胞核空间靠近的生物学意义和机制探讨  75
  4 小结  75-76
  5 论文总结和下一步工作计划  76-77
参考文献  77-81
附录  81-89
文献综述  89-99
  文献综述  96-99
相关论文  99-107
个人简历  107-108
致谢  108

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