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cagA转基因小鼠模型的建立及致病机制的初步研究

作　者: 管张燕
导　师: 刘纯杰
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: 密码子偏性 CagA 转基因小鼠 密码子优化 胃癌 幽门螺杆菌 表达谱芯片 AGS细胞
分类号: R-332
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori）是一种螺旋形、微需氧、具有端生鞭毛的革兰氏阴性杆菌。全球超过50%的人感染该菌,如不接受治疗则终生持续感染。接近30年的研究显示,H. pylori感染与胃肠道疾病的发生密切相关。在1994年,该菌被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌因子。H. pylori感染引发的胃肠道疾病包括慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关的淋巴样组织淋巴瘤（MALT）及胃腺癌。CagA蛋白是H. pylori致病的重要毒力因子之一,被列为至今首个来自细菌的癌蛋白。H. pylori利用IV分泌系统（Type IV secretion system, TFSS）将CagA蛋白注入到宿主胃上皮细胞中。进入细胞的CagA蛋白定位在质膜表面,并被细胞内酪氨酸激酶磷酸化。通过依赖和非依赖酪氨酸磷酸化的方式,CagA蛋白可以与宿主胞内多达20种蛋白发生直接相互作用、破坏多种信号通路,从而促进胃上皮细胞的恶性转化。CagA蛋白的羧基端具有显著的多态性。根据羧基端含有EPIYA片段的种类和数量,可以将CagA蛋白分为两种主要亚型:东亚型（East Asian）和西方型（Western）CagA蛋白。值得注意的是,在胃癌高发国家,如日本、朝鲜和中国,流行的H. pylori都具有东亚型CagA蛋白;在胃癌低发国家或地区,如欧洲、北美和澳大利亚,流行的H. pylori则具有西方型CagA蛋白。对不同亚型CagA蛋白的研究,或可为解释世界各地胃癌发病率和死亡率的差异提供线索。本课题构建了两种不同亚型CagA真核表达载体,将其分别转染胃上皮细胞AGS后,筛选得到了稳定转染细胞株;利用全基因表达芯片检测了不同亚型CagA蛋白对胃上皮细胞基因表达谱和功能的影响,并进行了部分实验验证。与此同时,构建了两种亚型cagA转基因小鼠,阳性鼠获得了明显的病理表型变化。本研究共分为以下三部分:1. cagA基因的优化、人工合成及分析我们选择两个H. pylori菌株:H. pylori 98-10和H. pylori Ca52,它们分别含有东亚型（ABD CagA）和西方型（ABC CagA）CagA蛋白。对它们的cagA基因序列进行分析,发现它们富含AT、剪切位点及ATTTA motif。在真核细胞中,过高的AT含量可能导致基因沉默,而且ATTTA motif是mRNA的降解基序。为了避免这些因素对cagA基因表达的影响,本实验根据（ http ://www.kazusa.org.jp/codon）提供的人密码子使用频率表,以人偏爱密码子替换H. pylori cagA基因的密码子,并调整AT含量、去除ATTTA motif和隐蔽的剪接位点。利用重叠PCR,人工全合成了优化的cagA基因( cagAHS ),并在cagAHS基因3′端连接了一个HA标签,获得了cagA 9810HS–HA基因和cagA Ca52HS–HA基因。将cagAHS-HA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1（+）,构建重组表达载体。将重组质粒瞬时转染胃上皮细胞AGS,应用RT-PCR和Western Blottling分别检测cagAHS-HA基因的转录和蛋白表达。结果表明,优化的cagAHS-HA基因能够有效、完整地表达CagA蛋白。2.不同亚型CagA蛋白对胃上皮细胞AGS功能的影响利用cagA 9810HS–HA基因和cagA Ca52HS–HA基因的重组表达载体转染AGS细胞,筛选耐G418的细胞克隆。通过PCR、RT-PCR及Western Blotting筛选鉴定cagA 9810HS–HA基因和cagA Ca52HS–HA基因稳定表达的AGS细胞系。从稳定表达cagA 9810HS–HA基因和cagA Ca52HS–HA基因的AGS细胞系培养物中提取总RNA,利用华联的HOA5.1基因表达芯片分别检测CagA 98-10蛋白和CagA Ca52蛋白对AGS细胞转录谱的影响。对差异表达基因进行分析,结果表明CagA 98-10蛋白和CagA Ca52蛋白显著影响多种细胞功能,而且这两种亚型CagA蛋白对细胞的影响和强度并不相同。芯片结果显示:（1）CagA 9810蛋白引起121个基因的转录显著变化（p≤0.01,FC≥2 ）;其中转录上调的基因有61个,转录下调的基因有60个。上调最大的10个基因是LOC100287188、FPR3、PPT2、XIST、SERPINB2、FSCN1、C6orf222、FAM109B、ITGA2和HOXB7,变化范围在3.3至36.7倍;下调最大的10个基因是NOTCH3、PLP1、H19、LY6D、TCF4、AMOT、CERK、SOHLH2、MAGED1和FBXO2,变化范围在-4.8至-9.3倍。（2）被CagA Ca52蛋白显著影响的基因有388个（p≤0.01,FC≥2）;其中有148个基因的转录上调,有240个基因的转录下调。上调最大的10个基因是SEMA5A、OLR1、TPPP、AKR1C3、C12orf59、PRSS35、ANXA1、SLC40A1、DKK1和HPGD,变化范围在3.8至9.6倍;下调最大的10个基因是DHRS2、UGT1A10、FPR3、TUBA1A、SYNPO、RSAD2、WNT6、FBXO2、CD40和MAP1B,变化范围在-10.5至-98.8倍。（3）被CagA 9810蛋白和CagA Ca52蛋白同时影响的基因有44个（p≤0.01,FC≥2）;同时上调的基因有ACTG2、CCDC80、GNE、GPR126和SARM1 ;同时下调的基因有AMOT、ANK1、C5orf13、C9orf169、FBXO2、GPRC5D、H19、IGFBP2、KCNN4、KLK6、LGALS3BP、LY6D、MAP1B、NCAM1、NOTCH3、PLA2G2A、PLP1、PSG1、RENBP、SULT2B1、TCF4、TMEM187、TRIB3、TUBA1A、UGT1A10和WNT6;调节相反的基因有F5、NKAIN4、CA2、BIRC7、FPR3、DMBT1、FPR3、CA2、CREB3L3、DKK1、SEMA3C、CFTR和SEMA5A。CagA 9810蛋白显著影响的细胞功能包括:对刺激的应激反应功能、营养功能、免疫防御功能和微管形成功能。CagA Ca52蛋白显著影响的细胞功能包括:甾类激素刺激的应激反应功能、炎性反应的调控功能、外部刺激反应的调控功能、循环系统功能。CagA 9810蛋白和CagA Ca52蛋白同时影响的细胞功能有包括:细胞黏附功能、细胞运动功能、细胞分化的正调控功能、微管的形成功能、外部刺激的应激反应功能、激素刺激的应激反应功能、机械刺激和损伤修复的应答功能。本研究不仅首次系统地揭示了CagA蛋白对AGS细胞表达谱的影响,并比较了不同亚型CagA蛋白对细胞功能的影响。3. cagA转基因小鼠的构建与病理变化为实现CagA在胃组织特异性表达,在cagA 9810HS基因和cagA Ca52HS基因的5′端分别连接小鼠H+/K+-ATPase 4β亚基的启动子。经显微注射,把转基因片段注射到小鼠的受精卵雄原核中。经PCR和RT-PCR鉴定,获得两个cagA Ca52HS转基因小鼠品系;六个cagA 9810HS转基因小鼠品系。cagA转基因小鼠的体重和行为并无明显异常。在cagA Ca52HS转基因小鼠的肝、脾、肺、肾、胃和肠中均检测到转录,说明H+/K+-ATPase 4β亚基的启动子并非具有严格的组织特异表达特性,存在渗漏表达现象。CagA 9810转基因小鼠的鼠龄还小,暂时未观察到明显病变。然而,9月龄的CagA Ca52转基因小鼠,胃黏膜层出现炎症反应和异常增生。14月龄的CagA Ca52转基因小鼠,出现严重的炎症反应、异常增生、类肠上皮化生以及异型核等癌前病变。这些结果证明CagA是重要的癌蛋白,单独CagA足以诱导肿瘤发生。

全文目录


摘要  3-6
ABSTRACT  6-10
缩略词表  10-11
目录  11-14
前言  14-22
  1. 幽门螺杆菌的致病因子  14-15
  2. TFSS 分泌系统与CagA 蛋白的转移  15-16
  3. CagA 蛋白的序列特征  16-18
    3.1 CagA 蛋白羧基端的EPIYA 基序  16-17
    3.2 CagA 蛋白羧基端的分泌信号  17
    3.3 CagA 蛋白氨基端的功能  17
    3.4 CagA 蛋白的CM 序列  17-18
  4. CagA 蛋白在细胞内的生物学功能  18-20
    4.1 CagA 蛋白的磷酸化修饰  18
    4.2 磷酸化CagA 蛋白的功能  18-19
    4.3 非磷酸化CagA 蛋白的功能  19-20
  5. 小结  20-22
第一章 cagA 基因的优化、人工合成及分析  22-52
  第一部分 菌源cagA 98-10 和cagA Ca52 基因的优化  23-36
    1. 材料  23
      1.1 CagA 蛋白序列  23
      1.2 软件及网址  23
      1.3 人密码子使用频率表  23
    2. 方法  23-25
      2.1 基因优化策略示意图  23
      2.2 GC 含量分析  23-24
      2.3 密码子偏性分析  24
      2.4 隐蔽剪接位点分析  24
      2.5 二核苷酸频率分析  24-25
    3. 结果  25-35
      3.1 CagA 蛋白序列的选择  25
      3.2 cagA 98-10 基因优化前后的生物信息学分析  25-29
      3.3 cagA Ca52 基因优化前后的生物信息学分析  29-35
    4. 讨论  35-36
  第二部分 cagA 98-10~(HS) 和cagA Ca52~(HS)基因的人工全合成  36-44
    1. 材料  36
      1.1 质粒和菌种  36
      1.2 酶及生化试剂  36
      1.3 寡聚核苷酸片段及引物  36
    2. 方法  36-40
      2.1 全基因合成策略  36-37
      2.2 基因片段的扩增  37-38
      2.3 基因片段的回收  38
      2.4 基因片段与载体连接、转化E.coli DH-5α  38-39
      2.5 挑选与鉴定期望重组菌  39-40
    3. 结果  40-42
      3.1 寡聚核苷酸片段及引物设计  40
      3.2 cagA 98-10 ~(HS) 基因的全合成  40-42
      3.3 cagA Ca52 ~(HS) 基因的全合成  42
    4. 讨论  42-44
  第三部分 cagA 98-10~(HS) 和cagA Ca52~(HS)基因的验证  44-52
    1. 材料  44
      1.1 质粒、菌种及细胞株  44
      1.2 酶及生化试剂  44
    2. 方法  44-46
      2.1 质粒pcDNA3.1-cagA Ca52~(HS) 和pcDNA3.1- cagA 9810~(HS) 的构建  44
      2.2 细胞转染用质粒的小量制备  44
      2.3 AGS 细胞的复苏、培养及冻存  44-45
      2.4 AGS 细胞的转染  45
      2.5 cagA ~(HS) 基因转录的鉴定  45-46
      2.6 cagA~(HS) 基因表达的检测  46
      2.7 转染cagA ~(HS) 基因的细胞形态观察  46
    3. 结果  46-49
      3.1 质粒pcDNA3.1- cagA 9810~(HS) 和pcDNA3.1-cagA Ca52~(HS) 的构建  46-47
      3.2 cagA 9810~(HS) 基因和cagA Ca52~(HS) 基因的转录鉴定  47-48
      3.3 cagA 9810~(HS) 基因和cagA Ca52~(HS) 基因的表达鉴定  48-49
    4. 小结  49-52
第二章 不同亚型CagA 对胃上皮细胞AGS 转录谱的影响  52-68
  1. 材料  52
    1.1 质粒及细胞株  52
    1.2 试剂  52
  2. 方法  52-55
    2.1 AGS 细胞的培养  52-53
    2.2 细胞转染用质粒的小量制备  53
    2.3 AGS 细胞的稳定转染  53
    2.4 稳定转染细胞基因组的提取  53
    2.5 稳定转染细胞的RT-PCR 鉴定  53
    2.6 稳定转染细胞的WB 鉴定  53
    2.7 MTS 检测稳定转染细胞的增殖  53-54
    2.8 凋亡检测  54
    2.9 芯片实验  54
    2.10 RealTime-PCR  54-55
  3. 结果  55-66
    3.1 cagA Ca52~(HS) 和cagA 9810~(HS) 的稳定转染细胞系  55
    3.2 MTS 法检测稳定转染细胞增殖  55
    3.3 稳定转染细胞凋亡检测  55-57
    3.4 RNA 样品的质量检测  57-58
    3.5 差异基因的聚类分析  58-59
    3.6 CagA Ca52 蛋白对AGS 细胞基因表达谱的影响  59-61
    3.7 CagA 9810 蛋白对AGS 细胞基因表达谱的影响  61-62
    3.8 不同亚型CagA 蛋白对AGS 表达谱影响的比较  62
    3.9 RealTime RT-PCR 验证  62-66
  4. 讨论  66-68
第三章 cagA 转基因小鼠的构建  68-82
  1. 材料  68
    1.1 菌株和质粒  68
    1.2 酶和生化试剂  68
  2. 方法  68-71
    2.1 质粒DNA 的小量提取  68
    2.2 cagA Ca52~(HS) 和cagA 9810~(HS) 的转基因载体构建  68-69
    2.3 显微注射用DNA 片段的制备  69
    2.4 受精卵的显微注射  69
    2.5 小鼠基因组DNA 的制备  69
    2.6 转基因小鼠的基因型鉴定  69-70
    2.7 小鼠组织总RNA 的提取  70
    2.8 cagA HS 转基因小鼠的基因表达鉴定  70
    2.9 组织切片的H.E 染色  70-71
  3. 结果  71-79
    3.1 cagA Ca52~(HS) 和cagA 9810~(HS) 的转基因载体构建  71
    3.2 cagA Ca52~(HS) 和cagA 9810~(HS) 转基因首建鼠的建立  71-73
    3.3 cagA Ca52~(HS) 和cagA 9810 HS 转基因首建鼠的传代  73
    3.4 CagA Ca52 在转基因小鼠组织中的表达  73
    3.5 cagA Ca52~(HS) 转基因小鼠的胃肠病理变化  73-78
    3.6 cagA Ca52~(HS) 转基因小鼠肝、脾和肾的病理变化  78-79
  4. 讨论  79-82
参考文献  82-88
附录  88-98
个人简介  98-100
致谢  100-102
发表文献  102-109

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中图分类: > 医药、卫生 > 医学研究方法 > 实验医学、医学实验 > 医用实验动物学
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