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合欢皮抑制血管新生有效组分分离与其作用机制探讨

作　者: 李倩
导　师: 邱丽颖
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 合欢皮 HMEC-1 EGF 苷类药效凋亡
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肿瘤的生长、转移都要依靠肿瘤血管新生为之提供营养和途径，因此通过抑制肿瘤血管新生就成为肿瘤治疗的一种重要方法。血管内皮细胞在血管发生中具有重要作用，通过抑制它的增殖可以抑制肿瘤血管生成，进而抑制肿瘤的恶性生长和转移。本论文用HMEC-1(人微血管内皮细胞)作为药物活性筛选模型，从合欢皮有效组分中分离出抑制内皮细胞生长的有效物质，并在该细胞上对有效物质的作用机制进行初步探讨。本论文以合欢皮乙醇回流-正丁醇萃取相(组分1)为原料，通过HP-20大孔树脂20%、70%乙醇梯度洗脱得到产物(组分2、3)，通过Molish反应与Fehling反应对产物进行理化性质鉴定，反应结果显示组分1、2、3均为总苷类物质；溶血反应检测苷物质类别，结果显示组分1、3为皂苷类物质，再将总苷类物质进行酸水解反应得到相应的苷元物质(组分4、5、6)，将上述6组分以HMEC-1进行活性筛选，同时测定细胞培养基上层中LDH的活力，对药物的毒性作用进行评价，结果为组分1在HMEC-1上IC50为3.49±0.03μg/mL，在12.5μg/mL时无细胞毒作用，组分3的IC50为2.17±0.13μg/mL，在5μg/mL时无细胞毒作用。用EGF诱导体外HMEC-1生长，发现2个组分均能抑制由EGF诱导的HMEC-1生长，也均能抑制由EGF诱导的HMEC-1细胞迁移与成管，且具有剂量依赖性；Westernblot检测信号通路PI3K/AKT与Ras/Raf/MEK/ERK中p-Akt与p-Erk1/2蛋白的表达，结果显示组分1、3均抑制了p-Akt的表达，且具有剂量依赖性；同时组分1在5μg/mL，组分3在2.5μg/mL下对p-Erk1/2的表达也有很强的抑制作用。并且发现，口服有效物质也具有良好效果。用台盼蓝染色法与Hoechst33342对细胞进行了坏死与凋亡检测，结果发现组分1在5μg/mL，组分3在2.5μg/mL下不会造成细胞坏死；流式细胞仪检测有效组分对细胞周期变化无明显的影响，对细胞凋亡有明显的作用；Western blot检测细胞中凋亡蛋白Caspase-3的变化，发现随着组分浓度的增加，Caspase-3蛋白被激活，进一步说明了有效组分对HMEC-1细胞的促凋亡作用，且在相同浓度下，组分3作用强于组分1。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-8
本论文专用术语  8-9
第一章绪论  9-17
  1.1 肿瘤现状  9
  1.2 以血管为靶点的治疗方法  9
  1.3 肿瘤和血管生成的关系  9-10
  1.4 与血管生成相关的因子及其受体  10-11
  1.5 细胞信号转导相关通路  11-12
    1.5.1 PI3K/AKT 信号通路与细胞生长、凋亡的关系  11-12
    1.5.2 Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路与细胞生长、凋亡的关系  12
  1.6 抗肿瘤血管新生物质  12-13
  1.7 中药抗肿瘤研究  13-14
  1.8 细胞凋亡与中药抗肿瘤  14-15
  1.9 合欢皮研究现状  15-17
第二章合欢皮中抗肿瘤血管新生有效物质的筛选  17-27
  2.1 引言  17
  2.2 实验材料  17-18
    2.2.1 细胞株  17
    2.2.2 药品及试剂  17-18
    2.2.3 仪器  18
  2.3 实验方法  18-21
    2.3.1 有效组分的提取分离  18-19
    2.3.2 各组分理化性质鉴定  19-20
    2.3.3 有效组分活性及毒性评价  20-21
  2.4 结果与讨论  21-25
    2.4.1 各组分理化性质鉴定  21
    2.4.2 皂苷类鉴定结果  21-23
    2.4.3 各组分活性结果  23-24
    2.4.4 HMEC-1 细胞外液 LDH 测定结果  24-25
  2.5 本章小结  25-27
第三章有效物质对 EGF 诱导 HMEC-1 生长的抑制作用机制探讨  27-39
  3.1 引言  27
  3.2 实验材料  27
    3.2.1 细胞株及小鼠  27
    3.2.2 药品及试剂  27
    3.2.3 仪器  27
  3.3 实验方法  27-29
    3.3.1 有效物质对各生长因子诱导 HMEC-1 生长的抑制作用  27-28
    3.3.2 有效物质对 HMEC-1 细胞迁移力的评价  28
    3.3.3 有效物质对 HMEC-1 细胞成管能力评价  28
    3.3.4 HMEC-1 全细胞蛋白电泳  28
    3.3.5 Western blot 检测 PI3K-Akt 和 Erk1/2 通路相关蛋白的表达  28-29
    3.3.6 体内 Matrigel 胶血管生成实验  29
  3.4 实验结果与讨论  29-37
    3.4.1 有效物质对各生长因子诱导 HMEC-1 生长的抑制作用结果  29-30
    3.4.2 有效物质对 HMEC-1 迁移力的作用  30-32
    3.4.3 有效物质对 HMEC-1 细胞成管能力的作用  32-33
    3.4.4 HMEC-1 全细胞蛋白电泳结果  33-34
    3.4.5 Western blot 检测 p-Akt 及 p-Erk1/2 蛋白的变化  34-37
    3.4.6 体内 Matrigel 胶血管生成实验结果  37
  3.5 本章小结  37-39
第四章有效物质诱导 HMEC-1 细胞凋亡及其机制探讨  39-49
  4.1 引言  39
  4.2 实验材料  39-40
    4.2.1 细胞株  39
    4.2.2 药品及试剂  39-40
    4.2.3 仪器  40
  4.3 实验方法  40-41
    4.3.1 台盼蓝染色检测细胞活力  40
    4.3.2 流式细胞仪检测 DNA 含量及细胞周期  40
    4.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡：Annexin V-FITC/ PI 双染色流式细胞术检测  40-41
    4.3.4 Hoechst33342 染色检测细胞凋亡  41
    4.3.5 Western blot 分析 Caspase-3 蛋白  41
  4.4 实验结果  41-48
    4.4.1 台盼蓝染色结果  41
    4.4.2 有效物质对细胞周期的影响  41-43
    4.4.3 细胞凋亡检测结果  43-45
    4.4.4 有效物质对 HMEC-1 细胞 Hoechst 33342 染色结果  45-47
    4.4.5 Western blot 检测 Caspase-3 蛋白变化  47-48
  4.5 本章小结  48-49
第五章结论与展望  49-50
  5.1 主要结论  49
  5.2 存在问题及展望  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-57
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  57

合欢皮抑制血管新生有效组分分离与其作用机制探讨

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