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阿魏酸抗辐射活性及其作用机制研究

作　者: 洪倩
导　师: 高月; 马增春
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: 阿魏酸抗辐射药物分子机理信号通路
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的:随着社会的进步和发展，放射性核技术越来越多的被推广和应用，极大的加剧了放射性核损伤对人类造成的伤害。辐射可以引起多种类型的急性放射病,如骨髓型、肠型和脑型等等，若不及时治疗后果不堪设想。因此，加强对放射病的防护和治疗一直是该领域研究的难点和热点。目前已有一些药物能发挥较好的抗辐射治疗作用，但都因毒副作用大，难以推广应用。从天然药物中寻找高效低毒的辐射防护剂已成为抗辐射研究的热点。本实验是建立在对复方四物汤抗辐射深入研究的基础上，筛选出其中有效成分阿魏酸，并利用现代生物学技术对阿魏酸的抗辐射作用机制进行了系列研究和探讨，对其体内外的抗辐射活性做了初步评价。方法：本研究探讨了阿魏酸的抗辐射作用，观察了阿魏酸对辐射后人脐静脉内皮细胞、淋巴细胞、及小鼠的保护作用，并从细胞水平、分子水平及整体水平等方面探讨其作用机理。辐射引起人脐静脉内皮细胞过氧化损伤，我们检测了辐射（10Gy）后细胞内活性氧、谷胱甘肽、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的变化，通过Western blot、RT-PCR等分子生物学手段，在蛋白及基因水平观察了阿魏酸对辐射后抗氧化因子（谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚单位、NADPH醌氧化还原酶及血红素加氧酶）表达的影响，同时进行了信号通路及分子靶点的研究。辐射会诱导人脐静脉内皮细胞发生炎症反应，引起血管壁的粘连和损伤。辐射后（10Gy），以U937细胞与内皮细胞的粘附作为评价指标，观察了阿魏酸的抗粘附作用。在此基础上，通过现代生物学实验方法检测了细胞间粘附分子、血管细胞间粘附分子的表达变化情况，探讨了阿魏酸的抗辐射作用，同时进行了作用机制研究。淋巴细胞对辐射反应极其敏感，通过辐射造模（3Gy），建立淋巴细胞凋亡模型，通过Hoechst33342染色和Annexin V-FITC-PI定量检测了阿魏酸的抑凋亡作用，并考察了介导细胞凋亡的线粒体途径、caspase家族等信号通路的变化，初步分析了阿魏酸发挥辐射保护的作用机制。低剂量辐射会引起小鼠造血功能的一系列变化，我们给予Balb/c小鼠2.5Gy的60Coγ照射，考察了阿魏酸对小鼠外周血白细胞、红细胞、血小板及血红蛋白值的影响，对造血祖细胞集落生成的促进作用、检测了粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素的表达变化以及可能的作用途径。结果：1.阿魏酸能够显著升高受照射内皮细胞的抗氧化相关基因（谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚单位、NADPH醌氧化还原酶及血红素加氧酶）的转录；促进Nrf2的核转录活性并升高辐射细胞中谷胱甘肽和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水平。信号通路的研究显示阿魏酸是通过PI3K和ERK信号通路进而激活Nrf2的表达及核转录从而发挥抗氧化活性；2.阿魏酸能够抑制辐射引起的U937细胞与内皮细胞的粘附，在蛋白及核酸水平剂量依赖性地抑制辐射引起的细胞间粘附分子、血管细胞间粘附分子的升高。进一步研究发现，阿魏酸是通过阻断JNK信号通路发挥了抗粘附作用，从而保护内皮细胞免受辐射的影响；3.辐射后淋巴细胞大量凋亡而阿魏酸可以扭转这一现象，同时降低辐射引起细胞内活性氧的升高和细胞内钙离子浓度、抑制caspase-3的活性、细胞色素c的转移及保护DNA免受断裂，对凋亡因子Bcl-2、Bax也有一定的正向调节，进而通过对MAPK信号通路的研究发现，阿魏酸可以通过ERK信号通路抑制辐射引起的凋亡及氧化损伤；4.阿魏酸能促进小剂量照射后的小鼠外周血白细胞、血小板值的恢复，促进造血祖细胞集落的生长，明显提高辐射引起的粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素的降低，从而发挥良好的辐射保护作用。结论：综上所述，体内外实验研究表明阿魏酸具有较好的抗辐射作用，能有效地抑制辐射引起的细胞损伤，提高细胞活力，抑制细胞凋亡。阿魏酸的辐射防护机制包括：①阿魏酸能抑制辐射诱导的细胞过氧化损伤，提高各种抗氧化基因的表达，降低辐射引起机体活性氧的增多，促进照射后Nrf2由胞质向胞核的转移，其作用机制极有可能是启动了Nrf2-ARE信号通路进而引发抗氧化基因的表达从而发挥抗氧化作用；②阿魏酸能抑制辐射引起的粘附损伤，降低粘附分子的表达，其机制可能是通过JNK通路引起AP-1转录因子的激活，从而产生缓解辐射引起的炎症表达作用；③阿魏酸通过提高线粒体功能，调节凋亡因子Bcl-2、Bax达到抑制凋亡的目的，信号通路的检测发现，在MAPK途径中，阿魏酸主要抑制了JNK与ERK磷酸化，对p38MAPK活性影响不大；④阿魏酸能通过调节粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素的生成，促进照射后小鼠外周血象的恢复以及造血祖细胞集落的生长，发挥良好的在体辐射保护机制。因此，阿魏酸有望开发成为高效低毒的抗辐射药物。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-11
英文缩略词中英文全称对照表  11-13
前言  13-16
第一部分阿魏酸对辐射所致内皮细胞氧化损伤的干预作用  16-27
  一、实验材料  16-17
  二、实验方法  17-19
  三、实验结果  19-25
  四、讨论  25-27
第二部分阿魏酸对辐射所致内皮细胞粘附损伤的干预作用  27-42
  一、实验材料  27-28
  二、实验方法  28-31
  三、实验结果  31-41
  四、讨论  41-42
第三部分阿魏酸对辐射所致淋巴细胞凋亡的干预作用  42-57
  一、实验材料  42-43
  二、实验方法  43-47
  三、实验结果  47-54
  四、讨论  54-57
第四部分阿魏酸对辐射损伤小鼠造血功能的影响  57-65
  一、实验材料  57
  二、实验方法  57-59
  三、实验结果  59-63
  四、讨论  63-65
结论  65-68
参考文献  68-79
综述  79-90
  参考文献  85-90
个人简历及在读期间发表论文  90-92
致谢  92-94
附件  94-125

阿魏酸抗辐射活性及其作用机制研究

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