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甘草HMGR，SQS1和β-AS基因CNVs与甘草酸、甘草苷含量相关性研究

作　者: 詹鑫婕
导　师: 刘春生
学　校: 北京中医药大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 甘草甘草苷甘草酸 CNVs HMGR SQS1 β-AS
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)是中医临床方剂中使用频率最高的中药,在国内外需求量都很大。甘草酸是甘草中最主要的有效成分,其含量高低是评价甘草药材质量标准的重要指标。近年来栽培甘草已成为甘草药材市场的主流商品,但栽培甘草中甘草酸含量普遍偏低,达不到《中国药典》的要求,严重制约了中医临床疗效和制药企业原料质量。因此,要提高栽培甘草药材中甘草酸含量,选育出优良品种的甘草是关键。由于甘草酸含量变化的遗传机制尚不明确,导致以提高甘草酸含量为目标的甘草优良品种研究进展缓慢。全面揭示甘草酸含量变化的遗传机制具有重要意义和应用前景。在本实验室的前期研究中,我们已利用甘草酸生物合成途径中的3个功能基因HMGR、SQS1和p-AS基因的单核苷酸多态性(SNPs)揭示了甘草酸生物合成的部分分子机制,但高甘草酸含量基因型中仍有30%-40%为低含量,说明功能基因SNPs不能完全揭示甘草酸含量变化遗传机制。此外,我们还发现这3个功能基因拷贝数变异(CNVs)与甘草产地、形态特征存在相关性。因此,本研究将进一步从3个功能基因CNVs入手,分析其与甘草酸含量的相关性,从CNVs对甘草酸、甘草苷含量的影响角度揭示甘草酸含量差异的基因表达机制。本论文拟对Real time PCR检测甘草HMGR、SQS1、β-AS基因拷贝数的方法进行改良,扩大检测样本数,检测栽培甘草HMGR、SQS1、β-AS基因的CNVs,筛选出具有不同拷贝数的基因组合类型,分析其与甘草酸、甘草苷含量的相关性,为全面揭示甘草酸含量变化的遗传机制奠定基础。本论文的主要结果如下：(1)改良了Real time PCR检测甘草基因组中HMGR、SQS1和β-AS基因拷贝数的方法。(2)检测62份栽培甘草样品3个基因拷贝数。甘草基因组中HMGR、SQS1、β-AS基因均存在1个和2个拷贝,其中HMGR基因主要为单拷贝,单拷贝个体有55个,占总样本数的88.7%,双拷贝个体有7个；SQS1基因主要为双拷贝,单拷贝个体有11个,双拷贝个体有51个,占总样本数82.3%；β-AS基因主要为双拷贝,单拷贝个体有7个,双拷贝个体有55个,占总样本数88.7%。(3)分析甘草3个功能基因拷贝数组合多态性。将甘草样品按不同功能基因拷贝数组合分为6种类型,β-AS、HMGR和SQS1基因拷贝数为1+1+1为B型,1+2+1为A型,2+1+1为H型,2+1+2为I型,2+2+1为F型,2+2+2为G型。其中I型在总样品中所占比例最高,达74.2%。(4)检测62份栽培甘草样品甘草酸、甘草苷含量。62份样品中甘草苷、甘草酸含量都存在着较大幅度的差异。甘草苷的含量最高为2.21%,最低为0.07%,均值为0.55%,最高含量为最低含量的31.6倍；甘草酸的含量最高为3.33%,最低为0.59%,均值为1.51%,最高含量为最低含量的5.6倍。单株分析发现,甘草苷含量和甘草酸含量呈正相关(r2=0.515)。(5)分析甘草3个基因拷贝数与甘草酸、甘草苷含量相关性。HMGR基因的单拷贝和双拷贝个体中甘草酸、甘草苷含量不存在显著性差异,SQS1基因和β-AS基因单拷贝更有利于甘草酸、甘草苷的积累。根据β-AS、HMGR、SQS1基因不同拷贝数组合类型将甘草样品进行分组,我们比较各组甘草苷、甘草酸含量,甘草苷含量最高的类型为A型(2.21%),最低为H型(0.31%)。通过方差分析,说明各组间的甘草苷、甘草酸含量存在显著性差异。甘草苷含量在B型与A型、H型、I型、G型存在显著性差异；A型与H型、I型和G型存在显著性差异；H型与F型存在显著性差异；甘草酸含量最高(3.33%)的类型为A型,最低为I型(1.35%),B型与H型、I型、G型存在显著性差异；A型与I型和G型存在显著性差异。但各组内除了H型甘草苷含量SD值较小,其余组甘草苷、甘草酸含量离散程度较大。这个结果提示A、B、F型可能与甘草酸、甘草苷高含量有关。但拷贝数组合多态性不能单独解释所有样本中甘草苷、甘草酸含量的变异。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
英文略缩语  10-11
前言  11-13
第一章文献综述及本论文研究思路  13-23
  1 文献综述  13-19
    1.1 甘草植株中甘草酸含量差异研究现状  13
    1.2 甘草酸生物合成研究进展  13-14
    1.3 基因拷贝数变异的研究现状  14-16
    1.4 基因拷贝数的检测方法研究进展  16-19
  2 研究思路与方法  19-23
    2.1 研究目标  19-20
    2.2 研究内容  20
    2.3 研究方案  20-22
    2.4 技术路线  22-23
第二章 REAL TIME PCR测定甘草HMGR、SQS1、B-AS基因拷贝数  23-45
  1 实验材料、试剂及仪器  23-24
    1.1 植物材料  23
    1.2 菌体和质粒  23
    1.3 试剂  23-24
    1.4 仪器和耗材  24
  2 溶液及培养基配制  24-25
  3 实验方法  25-30
    3.1 甘草总DNA提取  25
    3.2 内标基因的确定  25
    3.3 甘草HMGR、SQS1、β-AS、Lectin基因的获得  25-27
    3.4 甘草HMGR、SQS、β-AS、Lectin基因质粒标准品的获得  27-28
    3.5 Real time PCR标准曲线的建立  28-29
    3.6 Real time PCR扩增  29-30
  4 实验结果  30-42
    4.1 甘草总DNA的提取  30
    4.2 基因片段的扩增  30-31
    4.3 菌液(含质粒标准品)PCR鉴定  31
    4.4 序列分析  31-33
    4.5 标准曲线的建立  33-35
    4.6 熔解曲线分析  35-37
    4.7 甘草样品Real time PCR扩增  37-38
    4.8 甘草样品Real time PCR扩增结果  38-40
    4.9 甘草HMGR、SQS1、β-AS基因CNVs分析  40-41
    4.10 甘草基因不同拷贝数组合的筛选  41-42
  5 小结与讨论  42-45
    5.1 小结  42-43
    5.2 讨论  43-45
第三章 HPLC测定甘草中甘草酸、甘草苷含量  45-56
  1 实验材料、试剂及仪器  45
    1.1 植物材料  45
    1.2 试剂  45
    1.3 仪器和耗材  45
  2 实验方法  45-47
    2.1 对照品溶液制备  45
    2.2 供试品溶液制备  45
    2.3 色谱条件  45-46
    2.4 线性关系考察  46
    2.5 精密度试验  46
    2.6 重复性试验  46
    2.7 稳定性试验  46
    2.8 加样回收率  46-47
    2.9 样品测定  47
  3 实验结果  47-54
    3.1 对照品溶液色谱图  47-48
    3.2 供试品溶液色谱图  48-49
    3.3 线性关系考察  49
    3.4 精密度试验  49-50
    3.5 重复性试验  50
    3.6 稳定性试验  50-51
    3.7 加样回收率试验  51
    3.8 样品测定  51-54
  4 小结和讨论  54-56
    4.1 小结  54
    4.2 讨论  54-56
第四章甘草HMGR、SQS1、B-AS基因CNVS和甘草酸含量相关性分析  56-64
  1 甘草HMGR基因CNVs与甘草酸、甘草苷含量相关性分析  56-57
  2 甘草SQS1基因CNVs与甘草酸、甘草苷含量相关性分析  57-58
  3 甘草B-AS基因CNVs与甘草酸、甘草苷含量相关性分析  58-59
  4 甘草3个基因拷贝数组合多态性与甘草酸、甘草苷含量相关性分析  59-62
  5 小结和讨论  62-64
    5.1 小结  62
    5.2 讨论  62-64
第六章总结和展望  64-66
  1 总结  64-65
  2 展望  65-66
参考文献  66-71
附录  71-81
致谢  81-82
个人简历  82

甘草HMGR，SQS1和β-AS基因CNVs与甘草酸、甘草苷含量相关性研究

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