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基于单核苷酸多态性的食品中大肠埃希氏菌溯源技术

作　者: 赵宏
导　师: 李君文
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 食品污染大肠埃希氏菌单核苷酸多态性（SNP）持家基因溯源 eBURST分析
分类号: R155.5
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目前，食品安全问题已成为我国继人口、资源、环境之后的第四大社会问题。在所有食品安全问题中，由致病菌或条件致病菌的污染引起的食品安全事件又占有相当大的比重。在这些致病菌中由致病性大肠埃希氏菌引起的食品安全问题尤其值得人们关注。从肆虐全球30年可引起腹泻、出血性肠炎等疾病的大肠埃希氏菌O157︰H7到近期出现在德国的大肠埃希氏菌O104︰H4疫情，所有这些由致病性大肠埃希氏菌引发的公共卫生事件造成了严重的人员及财产损失并引发了全球的高度关注。因此，建立一种可以对不同地理来源的大肠埃希氏菌进行有效追溯的方法将对于控制食源性感染、追溯食品中致病性大肠埃希氏菌来源将起到重要作用。目前，大肠埃希氏菌溯源研究主要集中在寄主溯源，并且多种分子生物学技术运用于该领域的研究中。与其他分子溯源技术相比，MLST技术以其流程标准化，结果易于验证，重复性好，数据便于通过互联网共享等特点在多种细菌来源追溯研究中被广泛使用。但是MLST技术依靠大量基因测序，不适用于大量样本的溯源检测。而SNP检测技术使用简单、便捷、低成本的方法就可以获得可靠结果。因此，基于大肠埃希氏菌持家基因SNP溯源分析技术逐渐成为新兴热点。但是SNP技术在大肠埃希氏菌地理来源追溯方面的研究仍是空白。本研究首次将SNP技术应用于大肠埃希氏菌的地理溯源研究。本研究简述如下：1.大肠埃希氏菌持家基因的选择。根据文献报道结合自行软件计算基因多态性值，选择大肠埃希氏菌四个持家基因clpX（caseinolytic peptidase X，酪蛋白水解蛋白酶X），fadD（acyl-CoA synthetase，酰基辅酶A合成酶)，mdh(苹果酸脱氢酶),uidA(beta-glucuronidase，葡萄糖苷酸酶)作为研究的目标基因。2.持家基因中多态性位点的筛选。以大肠埃希氏菌多位点序列分型数据库（MLST Database)数据为基础，采用生物学软件Minimum SNPs计算四个持家基因中能够反映位点分辨力的辛普森系数（即D值）、选择D值大于0.86并结合文献报道及人工序列比对选择候选位点。共获得12个SNP位点。3.不同地理来源大肠埃希氏菌菌株收集。从进口生畜肉及加工食品及食品原料中分离大肠埃希氏菌菌株。生畜肉来自四大洲，12个国家和地区：欧洲的丹麦（63株），德国（20株），爱尔兰（17株），法国（17株），西班牙（25株）；北美洲的美国（24株），加拿大（20株）；大洋洲的澳大利亚（9株），新西兰（3株）；亚洲的印度（45株），中国（6株）以及中国台湾（4株）。共253株。菌株经鉴定纯化后使用。4.通过测序，获得每株菌持家基因上的SNP位点。具体步骤为：确定大肠埃希氏菌四个持家基因测序引物，对四个持家基因分别进行PCR扩增、测序，生物信息学方法对多态性位点进行人工筛查分析，根据得到的多态性信息聚类分析。253株大肠埃希氏菌被聚为61个SNP Groups。在9个SNP Groups，菌株表现出按大洲聚集的现象：SNP Group5，SNP Group19，SNP Group39，SNPGroup42，SNP Group43，SNP Group55中全部菌株来源于欧洲；SNP Group59中全部菌株来源于大洋洲；SNP Group52中全部菌株来源于北美洲；SNP Group22中全部菌株来源于亚洲。对于菌株数小于等于2株的SNP Groups，得到了35个地理特异性SNP标记。其他SNP Group中菌株来源于不同大洲或不同国家，说明大肠埃希氏菌分离株具有丰富的遗传多样性。5.用10株隐藏来源的大肠埃希氏菌分离株进行盲样测试，以验证所得到的地理标记。盲样测试结果显示：10株分离菌中，按照洲际溯源准确率为80%；按照国家溯源准确率为60%。6.本研究尝试应用大肠埃希氏菌较保守的持家基因中的一定数量的SNP位点组合对大肠埃希氏菌地理来源进行追溯，结果显示SNP具备大肠埃希氏菌地理来源追溯的能力。7. eBURST分析与SNP分析在分离株群体遗传进化方面具有相关性，与SNP分析相比eBURST分析对于不同地理来源菌株的进化关系分析结果更加细致。通过eBURST分析显示了不同地理来源菌株存在相同起源株。这种情况表现在不论是相邻国家之间还是相距较远的国家之间都存在着同质性的克隆株复合体。提示大肠埃希氏菌在具有相同起源的基础上存在丰富的遗传多样性。

全文目录

缩略词表  7-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章前言  13-29
  1 引言  13-14
  2 大肠埃希氏菌  14-20
    2.1 大肠埃希氏菌概况  14-15
    2.2 大肠埃希氏菌生物学特性  15-16
    2.3 流行病学特点  16-20
      2.3.1 大肠埃希氏菌 O157︰H7  16-18
      2.3.2 大肠埃希氏菌 O104︰H4  18-20
  3 国内外细菌溯源技术研究进展  20-26
    3.1 细菌溯源  20
    3.2 细菌溯源技术  20-26
      3.2.1 分子溯源技术及分类  21-26
        3.2.1.1 脉冲场凝胶电泳  21-22
        3.2.1.2 限制性片段长度多态性  22
        3.2.1.3 肠杆菌基因间重复一致序列的聚合酶链式反应  22-23
        3.2.1.4 扩增片段长度多态性  23
        3.2.1.5 单核苷酸多态性  23-25
        3.2.1.6 细菌的核糖体基因分型  25
        3.2.1.7 多位点序列分析  25-26
  4 细菌溯源技术小结  26-27
  5 课题研究思路  27-29
第二章大肠埃希氏菌持家基因单核苷酸多态性位点的选择  29-37
  1 前言  29
  2 大肠埃希氏菌持家基因  29
  3 MLST 技术资源  29-30
  4 持家基因多态性位点的测算  30-35
    4.1 数据下载  31-34
      4.1.1 结合数据文件 st7-7.meg 数据下载  31-32
      4.1.2 Allele Sequences 数据下载  32
      4.1.3 结合数据文件的修正  32-33
      4.1.4 Allele Sequences 数据文件的修正  33-34
      4.1.5 Allele Sequences 数据文件修正结果检测  34
      4.1.6 人工定义的数据  34
    4.2 Minimum SNPs 测算  34-35
  5 持家基因多态性位点的选择  35-36
  小结  36-37
第三章食品中大肠埃希氏菌菌株的收集与鉴定、纯化  37-41
  1. 实验材料  37
    1.1 培养基及试剂  37
    1.2 仪器和耗材  37
  2 方法  37-40
    2.1 大肠埃希氏菌的分离培养  37-40
      2.1.1 主要溶液的配制  37-38
      2.1.2 操作步骤  38
      2.1.3 菌落鉴定  38-40
    2.2 分离得到的大肠埃希氏菌  40
  小结  40-41
第四章所选大肠埃希氏菌持家基因 SNP 位点的识别及分析  41-80
  1 实验材料  41
    1.1 主要试剂  41
    1.2 仪器和耗材  41
  2 方法  41-79
    2.1 大肠埃希氏菌基因 DNA 提取  41-43
      2.1.1 大肠埃希氏菌菌液制备  41
      2.1.2 大肠埃希氏菌 DNA 提取  41-42
      2.1.3 大肠埃希氏菌 DNA 纯度检测  42-43
    2.2 大肠埃希氏菌持家基因扩增  43-56
      2.2.1 PCR 引物  43
      2.2.2 PCR 反应体系  43-44
      2.2.3 PCR 反应条件  44
      2.2.4 PCR 扩增结果  44-56
        2.2.4.1 clpX 基因扩增结果  44-47
        2.2.4.2 fadD 基因扩增结果  47-50
        2.2.4.3 mdh 基因扩增结果  50-53
        2.2.4.4 uidA 基因扩增结果  53-56
    2.3 大肠埃希氏菌持家基因扩增产物测序  56
    2.4 大肠埃希氏菌持家基因扩增产物测序结果分析  56-70
      2.4.1 大肠埃希氏菌持家基因扩增产物测序结果  56
      2.4.2 大肠埃希氏菌持家基因扩增产物测序结果 SNP 分析  56-70
    2.5 基于持家基因 SNP Profiels 的大肠埃希氏菌菌株地理来源分析  70-77
      2.5.1 基于 12 个 SNP 位点信息对分离株进行聚类分析  70
      2.5.2 根据 12 个位点的 SNP 谱聚类分析  70-75
      2.5.3 地理特异性 SNP Profiels 及 SNP Group  75-77
    2.6 盲样测试  77-79
      2.6.1 盲样样品的准备  77
      2.6.2 盲样样品的 SNP 位点信息  77-78
      2.6.3 基于盲样 SNP 位点信息的来源分析  78-79
  小结  79-80
第五章大肠埃希氏菌分离株的 eBURST 分析  80-95
  1 大肠埃希氏菌分离株的 ST 型  80
  2 eBURST 分析  80-86
    2.1 数据的输入  80-81
    2.2 数据分析  81-82
    2.3 聚类图分析  82-83
    2.4 eBURST 分析与 SNP 分析的比较  83-86
  小结  86-95
结果  95-96
参考文献  96-102
菌种附录  102-108
综述  108-116
  参考文献  113-116
个人简历  116-117
致谢  117

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