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白细胞介素-2基因表达质粒对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

作　者: 王璐
导　师: 仲飞
学　校: 河北农业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 白细胞介素-2 生物佐剂细小病毒 VP2 DNA疫苗
分类号: S858.292
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一种高度接触性传染病。犬细小病毒属细小病毒科,细小病毒属。该病毒于1978年首次发现。该病毒可引起幼犬严重的肠炎,引起新生犬心肌炎。人们研究证明犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒主要抗原蛋白。研究证实由VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为提高VP2 DNA疫苗的免疫原性,本实验在小鼠体内尝试了利用犬白细胞介素2(cIL-2)基因增强VP2 DNA疫苗免疫应答的研究。通过RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中分别扩增含终止密码子和不含终止密码子的cIL-2 cDNA基因,然后将基因插入到真核表达载体pcDNA3.1中,分别构建成非融合的和与Myc/His融合的cIL-2基因真核分泌型表达载体,pcDNA-cIL-2和pcDNA-cIL-2/MH。将pcDNA-cIL-2/MH表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293FT细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导cIL-2在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2表达载体(pcDNA-CD5sp-VP2,本室构建)单注射和VP2/IL-2表达载体共注射对小鼠进行免疫(用pcDNA3.1载体作为阴性对照)。免疫后通过ELISA方法检测免疫后不同时期小鼠血清VP2的抗体水平,并通过细胞增殖实验检测免疫后小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应,用ELISA方法测定小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平。实验结果表明,本实验扩增的小鼠cIL-2基因与GenBank的参考序列一致,构建的cIL-2表达载体能够介导重组cIL-2在HEK293FT细胞中进行分泌表达。免疫结果显示,利用cIL-2/VP2表达载体共免疫小鼠,免疫后35d血清中VP2的抗体水平达到1: 5120,明显高于VP2表达载体单免疫组(P<0.01)。淋巴细胞增殖实验表明,两组免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于阴性对照组(P<0.01),共免疫组的刺激指数又明显高于单免疫组(P<0.05)。共免疫小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平明显高于单免疫组和阴性对照组(P<0.01)。这些结果表明,cIL-2表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平,这为IL-2作为生物佐剂在动物DNA疫苗的研究和应用提供了科学依据。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-16
  1.1 犬细小病毒  10-12
    1.1.1 犬细小病毒概述  10-12
      1.1.1.1 犬细小病毒的形态特点和理化性质  10
      1.1.1.2 犬细小病毒的基因组结构  10
      1.1.1.3 犬细小病毒编码的蛋白及功能  10-11
      1.1.1.4 犬细小病毒的发病机理  11
      1.1.1.5 犬细小病毒感染宿主范围  11
      1.1.1.6 犬细小病毒的预防  11-12
      1.1.1.7 犬细小病毒的流行现状  12
    1.1.2 犬细小病毒病  12
  1.2 白细胞介素2  12-15
    1.2.1 白细胞介素2 的产生  12-13
    1.2.2 白细胞介素2 的结构  13
    1.2.3 白细胞介素2 的受体  13-14
    1.2.4 白细胞介素2 的生物学功能  14
    1.2.5 白细胞介素2 的应用  14-15
  1.3 研究目的与意义  15-16
2 实验一犬白细胞介素2（cIL-2）基因的扩增、真核表达载体的构建及在HEK293FT 细胞中的表达  16-32
  2.1 实验材料  16-20
    2.1.1 菌株、载体和细胞  16
    2.1.2 主要试剂  16-17
    2.1.3 试验所用溶液及其配制  17-19
    2.1.4 主要仪器  19-20
  2.2 实验方法  20-29
    2.2.1 犬脾脏总RNA 的提取  20
    2.2.2 犬白细胞介素2（cIL-2）基因（含终止密码子和不含终止密码子）的扩增  20-22
    2.2.3 cIL-2 基因（含终止密码子和不含终止密码子）真核表达载体的构建  22-26
    2.2.4 重组cIL-2 蛋白的表达与鉴定  26-29
  2.3 结果与分析  29-30
    2.3.1 cIL-2 基因的扩增（含终止密码子和不含终止密码子）及表达载体的构建  29
    2.3.2 重组 cIL-2 在 HEK293FT 细胞中的分泌表达  29-30
  2.4 讨论  30-32
3 实验二动物免疫实验  32-39
  3.1 实验材料  32-33
    3.1.1 菌株、载体、细胞和病毒  32
    3.1.2 主要试剂  32
    3.1.3 主要仪器  32-33
    3.1.4 实验动物  33
  3.2 实验方法  33-35
    3.2.1 小鼠的免疫  33-34
    3.2.2 体液免疫应答反应  34-35
    3.2.3 细胞免疫应答反应  35
  3.3 结果与分析  35-38
    3.3.1 目的质粒DNA 的酶切鉴定  35-36
    3.3.2 体液免疫应答反应结果  36-37
    3.3.3 细胞免疫应答反应结果  37-38
  3.4 讨论  38-39
4 结论  39-40
5 参考文献  40-44
附录  44-47
在读期间发表的学术论文  47-48
作者简历  48-49
致谢  49-50

白细胞介素-2基因表达质粒对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

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