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警犬黄曲霉毒素中毒的诊断及其免疫抑制效应

作　者: 贺星亮
导　师: 陆承平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医
关键词: 犬 黄曲霉毒素 中毒 诊断 治疗 免疫抑制
分类号: S858.292
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 75次
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内容摘要


黄曲霉毒素是由黄曲霉菌属中的黄曲霉菌株和寄生菌株产生的一类多环芳香烃物质。在该类毒素中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)含量最多,毒性最强,具有基因毒性和细胞毒性,能造成多种类型的DNA损伤,具有明显的免疫抑制作用,引起动物免疫失败和感染性疾病的发生。关于犬AFB1中毒的报道相对较少。2007年南京某犬场因饲喂含有AFB1的犬粮,138头犬出现中毒。以该犬场的警犬为研究对象,对犬AFB1中毒的临床症状、病理、诊断、治疗及其免疫抑制效应进行了相关研究。1临床诊断对犬场的378头犬进行血液生化检查,有138头出现了谷丙转氨酶、谷草转氨酶异常,有71头犬出现了临床症状,其中有36头犬死亡。对71头患犬进行观察,患犬都出现精神沉郁,食欲下降,66.2%的患犬出现不同程度可视黏膜及皮肤黄染,52.1%的患犬出现粪便呈煤焦油样等症状；对全部36头死亡犬进行剖检,发现死亡犬皮肤、皮下脂肪黄染,肝坏死呈土黄色,心肌斑点状出血,腹腔积水,肠系膜广泛性出血,肠道出血等。采集12头死亡犬实质性脏器组织的120个样品作病理检查。死亡犬都出现胃黏膜充血出血,肠黏膜充血出血,肠绒毛轻微脱落,心肌细胞发生颗粒变性,脾脏明显充血,有炎性细胞浸润,淋巴结充血,局部组织疏松,呈网状或空泡状,淋巴窦扩张,充满大量浆液和炎性细胞,肺泡中充满大量红细胞,肺泡隔增厚,有炎性细胞浸润,肝脏明显充血出血,肝索紊乱肝细胞发生颗粒变性和水泡变性,并可见大小不一坏死区,有少量炎性细胞浸润,肾脏肾间质毛细血管充血,肾小管上皮细胞空泡变性。2毒素检测委托江苏省进出境动植物检验检疫局,采用高效液相色谱法对饲料及饲料原料、及死亡犬内脏11个批号的33个样品进行黄曲霉毒素检测。通过检测发现,070208号玉米,070215幼犬饲料、070309幼犬和成犬饲料中黄曲霉毒素B1分别达到0.854、0.2249、0.376和0.678mg/kg,B2分别达0.062、0.018、0.028和0.044mg/kg,而070208号玉米正是用于生产070215、070309犬饲料的原料。确诊该犬群系采食含有AFB1饲料而发生中毒。3血液生化指标检测及代谢物谱分析已采食被AFB1污染的饲料30d的30头犬的血液生化指标为实验组。以2006年3月9日健康检查相对应犬的生化指标为对照组。用SPSS15.0统计软件用t检验对实验数据进行统计分析。30头患犬采食AFB1污染的饲料30天后,谷丙转氨酶均值由37.7u/L上升到190.07u/L,谷草转氨酶、总胆红素、直接胆红素升高,胆碱酯酶、总蛋白和白蛋白降低。犬AFB1中毒前后7项生化指标变化均呈显著性差异(P<0.01)。通过气相色谱-质谱技术(GC-MS)分析AFB1中毒犬血浆中的代谢物谱,并运用主成分分析(PCA)方法对血浆内源性代谢物随中毒时间的变化情况进行识别。研究发现,随着AFB1中毒时间的延长,血浆中的如L-异亮氨酸、甘氨酸、L-苏氨酸、天冬氨酸、L-苯丙氨酸等氨基酸含量有所上升,L-异亮氨酸相对峰值面积由0.050(+0.008)上升到0.102(+0.001),与对照组相比有显著(P<0.05)。葡萄糖、胆固醇以及部分游离脂肪酸含量下降,胆固醇相对峰值面积由0.757(±0.061)下降到0.532(+0.074),与对照组相比有显著(P<0.05)。这些代谢物的变化都与肝脏的损伤程度密切相关,且变化趋势与血液生化指标检测结果一致。研究结果表明,基于GC-MS的代谢组学技术结合PCA的方法能较全面地反应生物体的代谢状态,有助于AFB1中毒的早期诊断。4治疗试验以4头健康犬为阴性对照,以7头AFB1中毒患犬为阳性对照,作基础治疗。其它35头中毒患犬分成5组,每组7头,除基础治疗外,分别采用谷胱甘肽、葡醛内酯、促肝细胞生长素和茵栀黄注射液进行特异性治疗。组间疗效比较用卡方检验。犬AFB1中毒的疗效不佳,实验组死亡率达69%,发生中重度中毒后,死亡率达100%。而轻度的AFB1中毒,通过采用谷胱甘肽、葡醛内酯、促肝细胞生长素联合治疗,总有效率(痊愈+显效+有效)能达到57.1%。5免疫抑制试验取1-3岁的健康犬,按20g/kg饲喂含AFB1浓度为340μg/kg的犬粮,于0d、7d、14d、21d和28d,用淋巴细胞转化实验和免疫组化方法分别对其淋巴细胞增殖能力和T淋巴细胞亚群组成进行检验。试验确定Con A刺激犬T细胞增值的最佳浓度是80μg/mL,对应的培养时间是48h,淋巴细胞浓度是1×106个/mL。LPS刺激犬B细胞的最佳浓度是100gg/mL,对应的培养时间是20h,淋巴细胞浓度是1×107个/mL。用Con A和LPS分别刺激AFB1中毒犬外周血T淋巴细胞和B淋巴细胞。发现中毒后7d T淋巴细胞增殖效应显著提高,14d到28d出现显著下降趋势。与0d相比,B淋巴细胞的增殖能力降低。CD3、CD4和CD8的比例均有明显下降,CD4/CD8比值也明显降低,AFB1使犬细胞免疫受到抑制。6对疫苗免疫效果的影响未经免疫三月龄的健康幼犬10头,随机分成2组,每组5头,分别注射1头份犬细小病毒疫苗。实验组按20g/kg饲喂含340μg/kg AFB1的犬粮,对照组按20g/kg饲喂不含AFB1同品牌犬粮。于0d,7d,14d,21d,28d采集血清,检测细小病毒中和抗体。结果显示,采食AFB1的犬血清犬细小病毒中和抗体和对照组相比显著降低(127.9/701.6)(P<0.01)。综上可见,AFB1引起了警犬中毒,表现食欲下降、黄疸、呕吐和血便等一系列症状,血液生化指标、血浆代谢物谱分析及病理变化的检测结果,同样证实诊断的正确。饲料中检出AFB可进一步确诊。治疗犬AFB1中毒患犬、主要为保肝和对症治疗。中、重度中毒治疗效果不理想。AFB1对犬的细胞免疫和体液免疫产生明显的抑制作用,致使犬免疫失败。

全文目录


摘要  8-11
ABSTRACT  11-15
符号及缩略语说明  15-16
第一章 文献综述  16-52
  第一节 黄曲霉毒素的研究进展  16-40
    1.1 霉菌毒素的概述  16-17
      1.1.1 霉菌毒素的概念  16
      1.1.2 霉菌毒素的污染现状  16-17
      1.1.3 霉菌毒素对动物机体的损害  17
    1.2 黄曲霉毒素的研究现状  17-23
      1.2.1 黄曲霉毒素的概述  17
      1.2.2 黄曲霉毒素的来源  17-18
      1.2.3 黄曲霉毒素的化学结构  18-19
      1.2.4 各国食品和和饲料黄曲霉毒素的允许含量  19-21
      1.2.5 黄曲霉毒素的代谢  21-23
    1.3 黄曲霉毒素的危害  23-32
      1.3.1 黄曲霉毒素毒理  23-24
      1.3.2 黄曲霉毒素中毒的表现  24-32
    1.4 黄曲霉毒素中毒主要临床症状  32-33
    1.5 黄曲霉毒素的检测方法  33-36
      1.5.1 黄曲霉毒素B1的检测方法与比较  34-35
      1.5.2 最新发展快速检测方法,IC法  35-36
    1.6 黄曲霉毒素的控制  36-38
      1.6.1 黄曲霉毒素的去除方法  37-38
      1.6.2 对黄曲霉毒素体内吸收与代谢的干预措施  38
    1.7 黄曲霉毒素中毒病的临床治疗方法  38-39
    1.8 霉菌毒素研究迫在眉睫  39-40
  第二节 犬与黄曲霉毒素  40-49
    2.1 黄曲霉毒素对犬的致病作用  40
    2.2 黄曲霉毒素对犬免疫系统的影响  40-41
      2.2.1 犬免疫系统特点  40-41
      2.2.2 黄曲霉毒素对犬免疫功能的影响  41
    2.3 犬黄曲霉毒素中毒后病理和临床症状  41-42
    2.4 犬黄曲霉毒素中毒的治疗及预后  42
    2.5 犬饲料  42-45
      2.5.1 我国犬饲料发展基本概况  42-43
      2.5.2 犬饲料质量分析  43
      2.5.3 影响犬饲料质量的主要因素  43-45
    2.6 保证犬饲料安全的对策  45-46
      2.6.1 进一步加强饲料法规建设  45
      2.6.2 强化饲料安全监控工作  45-46
      2.6.3 继续加强基础研究,健全饲料工业标准化体系  46
    2.7 犬饲料中霉菌毒素的控制  46-48
      2.7.1 生产过程中的质量控制  47-48
    2.8 犬黄曲霉毒素中毒的研究  48-49
  参考文献  49-52
第二章 警犬黄曲霉毒素中毒的诊断及其免疫抑制效应  52-120
  第一节 警犬发生黄曲霉毒素中毒的情况及临床诊断  52-69
    摘要  52-53
    1.1 材料与方法  53-54
      1.1.1 材料  53
      1.1.2 试剂  53
      1.1.3 仪器  53
      1.1.4 临床检查  53
      1.1.5 实验室检查  53-54
      1.1.6 鉴别诊断  54
    1.2 结果  54-63
      1.2.1 饲养管理情况  54
      1.2.2 发病情况  54-58
      1.2.3 剖检变化  58-60
      1.2.4 实验室检测结果  60
      1.2.5 病理切片结果  60-62
      1.2.6 鉴别诊断结果  62-63
    1.3 分析讨论  63-69
      1.3.1 中毒与症状  63
      1.3.2 中毒与黄疸  63
      1.3.3 中毒与便血,吐血  63-64
      1.3.4 中毒与体温  64
      1.3.5 中毒与实质性脏器损害  64-65
      1.3.6 中毒与其它肝脏疾病  65-69
  第二节 犬饲料原料和饲料中黄曲霉毒素检测  69-77
    摘要  69
    2.1 材料与方法  69-71
      2.1.2 仪器  69
      2.1.3 试剂  69-70
      2.1.4 待测样品  70
      2.1.5 样品的处理  70
      2.1.6 配制标准曲线  70
      2.1.7 色谱条件  70-71
      2.1.8 衍生条件  71
    2.2 结果与分析  71-74
      2.2.1 衍生反应条件  71-72
      2.2.2 标准曲线与检出限  72-73
      2.2.3 回收率试验  73
      2.2.4 样品的检测  73-74
    2.3 讨论与分析  74-77
  第三节 犬黄曲霉毒素B_1中毒后血液生化指标检测及代谢物谱分析  77-87
    摘要  77-78
    3.1 材料和方法  78-80
      3.1.1 实验犬  78
      3.1.2 仪器和试剂  78
      3.1.3 黄曲霉毒素  78-79
      3.1.4 血液生化检查样品的采集  79
      3.1.5 代谢谱分析样品采集  79
      3.1.6 血液生化分析  79
      3.1.7 血常规检测  79
      3.1.8 样品预处理与GC-MS分析  79
      3.1.9 数据采集和处理  79-80
    3.2 结果  80-84
      3.2.1 血液生化指标的变化  80
      3.2.2 GC-MS代谢物谱分析  80-82
      3.2.3 代谢物谱模式变化  82-83
      3.2.4 代谢物含量的变化  83
      3.2.5 血常规检查  83-84
    3.3 分析讨论  84-87
  第四节 犬黄曲霉毒素B1中毒的治疗  87-95
    摘要  87
    4.1 材料与方法  87-90
      4.1.1 实验动物  87
      4.1.2 实验药物  87
      4.1.3 临床试验设计  87-88
      4.1.4 实验犬和药物分组  88
      4.1.5 药物使用方法和疗程  88-89
      4.1.6 临床和试验室观察指标  89
      4.1.7 疗效判定  89-90
      4.1.8 数据分析与统计处理  90
      4.1.9 肝功能检查  90
    4.2 结果  90-92
    4.3 分析讨论  92-95
  第五节 黄曲霉毒素B1对犬免疫抑制试验  95-113
    摘要  95
    实验一 犬T/B淋巴细胞转化试验最佳条件的研究  95-100
      5.1.1 材料与方法  96-97
      5.1.2 结果  97-99
      5.1.3 讨论  99-100
      5.1.4 小结  100
    实验二 黄曲霉毒素B1对犬T/B淋巴细胞增殖影响的研究  100-107
      5.2.1 材料与方法  100-104
      5.2.2 结果  104-105
      5.2.3 讨论  105-106
      5.2.4 小结  106-107
    实验三 黄曲霉毒素B1对犬T细胞亚群影响的研究  107-113
      5.3.1 材料与方法  108-109
      5.3.2 结果  109-111
      5.3.3 讨论  111-112
      5.3.4 小结  112-113
  第六节 黄曲霉毒素B1对犬细小病毒疫苗免疫效果的影响  113-118
    摘要  113-114
    6.1 材料与方法  114-115
      6.1.1 实验动物  114
      6.1.2 疫苗和黄曲霉毒素  114
      6.1.3 试剂  114-115
    6.2 方法  115
      6.2.1 实验动物的分组  115
      6.2.2 采集血样  115
      6.2.3 中和抗体检测  115
    6.3 细小病毒疫苗免疫结果  115-116
    6.4 讨论  116-117
    6.5 小结  117-118
  参考文献  118-120
全文结论  120-122
本文创新点  122-124
攻读博士学位期间发表论文、著作和学术交流  124-126
致谢  126

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 犬
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