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EV71与干扰素相互作用的机理研究

作　者: 刘颖
导　师: 陈薇; 侯利华
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: EV71 干扰素信号通路 IFNAR1 Jak1
分类号: S852.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

EV71（Enterovirus71）引发的手足口病在近年来的发病率仍然很高。截止目前，对于EV71感染，尚没有有效的疫苗和治疗办法。干扰素作为广谱抗病毒药物，已成功用于多种病毒感染疾病的治疗，研究显示干扰素可抑制EV71的复制，但EV71病毒也可在一定程度上逃避干扰素的抑制作用。本实验旨在探索EV71拮抗干扰素抗病毒作用的机制。本实验获取五株EV71病毒：安徽株（Anhui2007）一株，VR1432和VR1775(购自ATCC，American Type Culture Collection，美国模式菌种保藏库)，GDV103和GDV102（购自CCTCC，China Center for Type Culture Collection，中国典型培养物保藏中心）。根据GenBank中EV71的全基因组序列设计了6对引物，分段扩增了覆盖EV71（安徽株，VR1432，GDV103）基因组全长序列的6个重叠片段，并进行序列测定和分析。三株EV71全基因组核苷酸序列已被GenBank数据库收录，Anhui2007（安徽株）、VR1432和GDV103的登陆编号分别为KC954662、KC954664和KC954663。进化树分析显示安徽株EV71和GDV103属于C基因型中的C4基因亚型，VR1432属于C基因型中的C2基因亚型。通过结晶紫染色的方法在Vero E6和MRC-5细胞上初步测定了IFN-ω和IFN-α对安徽株，VR1432，GDV103和GDV102四株病毒的保护效果。结果显示IFN-ω的整体保护效果要好于IFN-α，其中，IFN-ω保护VR1432、Anhui、GDV103和GDV102四株病毒感染细胞的EC50分别为1810.7IU/ml、931.5IU/ml、385.8IU/ml、40.6IU/ml；IFN-α2b保护GDV102感染细胞的EC50为846.9IU/ml，当IFN-α2b的浓度达到50000IU/ml时，对VR1432、Anhui、GDV103三株病毒感染的细胞仍没有达到100%的保护效果，同时发现病毒在Vero E6中比在MRC-5中对干扰素的保护作用更敏感。随后用定量PCR法（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）对经IFN-ω和IFN-α预处理的Vero E6细胞的两株EV71，GDV103和VR1432的拷贝数变化进行了测定。结果显示病毒拷贝数随干扰素浓度的升高呈现明显的下降趋势，且IFN-ω抑制病毒复制的能力要显著强于IFN-α2b。为了探索EV71与干扰素相互作用的机制，本实验研究了GDV103,VR1432感染MRC-5和RD细胞对干扰素信号通路的影响。本研究首先在转录和翻译水平检测了两株病毒是否能刺激MRC-5产生IFN-β,VSV作为阳性对照，反转录PCR（Reverse PCR，RT-PCR）和WB结果显示两株EV71均不能刺激MRC-5产生IFN-β。随后PCRArray检测了EV71感染对I型干扰素信号通路中各基因表达的影响。GDV103以MOI为10感染MRC-5细胞，未感染的为对照，随后用1000IU/ml的IFN-α2b刺激细胞1h。将四组细胞提取RNA后进行PCRArray分析，结果显示GDV103感染后显著抑制了IFN-α诱导的抗病毒基因的表达。即EV71通过抑制内源干扰素产生和拮抗外源干扰素作用从而利于其存活和复制。I型干扰素通过经典的JAK-STAT信号通路激活下游的抗病毒蛋白基因从而发挥抗病毒作用。EV71可以通过干扰此信号通路的任一环节来最终抑制抗病毒蛋白基因的转录和翻译。由于STAT1和STAT2的磷酸化是JAK-STAT信号通路中的关键环节，本研究首先检测了EV71感染对STAT1和STAT2磷酸化的影响。GDV103和VR1432以低MO（IMOI=1）感染MRC-5和Vero E6细胞时，WesternBlot显示p-STAT1，p-STAT2的量没有明显变化。将EV71感染的MOI提高为10后感染MRC-5和RD，WB结果显示IFNα-2b刺激细胞后，p-STAT1和p-STAT2的表达有明显增加，且随着EV71感染时间的延长，磷酸化的STAT1和磷酸化的STAT2的蛋白含量有明显下降，而STAT1和STAT2蛋白含量保持不变，即EV71感染MRC-5和RD细胞均抑制了STAT1和STAT2的磷酸化。此后，本研究继续检测了EV71感染对ISGF3核转位的影响，将pEGFP-C1-STAT1质粒转染Vero E6细胞，VR1432感染后加入干扰素，核质分离结果显示EV71感染抑制了ISGF3的核转位。既然STAT1、STAT2的磷酸化及随后的ISGF3的核转位均受到了抑制，本研究继续检测了其上游细胞膜上受体IFNAR1的表达，Western Blot和流式细胞分析结果均显示无论干扰素刺激与否，EV71感染均未影响IFNAR1受体的表达。本研究随之检测了与受体偶联的JAK（Janus activated kinse）激酶家族的Jak1和Tyk2的表达，Western Blot结果显示在MRC-5和RD细胞中，EV71感染下调了Jak1的表达，未影响Tyk2的表达，但抑制了IFNα-2b诱导的Jak1和Tyk2的磷酸化。随后本研究继续探讨了EV71下调Jak1的机制，qRT-PCR检测显示随着EV71感染时间的延长，Jak1的mRNA水平没有下降，即Jak1蛋白的下降未发生在转录水平。由于蛋白酶体通路是病毒介导的降解信号通路中信号分子的一种普遍途径，本研究用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后，Western Blot显示EV71感染引起Jak1的下调并未得到恢复，即Jak1的减少不依赖于蛋白酶体通路。接下来考察了EV71诱导的自噬溶酶体途径对Jak1蛋白的影响，用自噬抑制剂3-MA处理细胞后检测EV71感染对Jak1表达的影响，结果显示3-MA加入后EV71感染引起的Jak1的下降未得到补偿，即Jak1的减少可能不是细胞自噬引起的。随后用溶酶体抑制剂E64处理细胞，Western Blot检测Jak1在EV71感染后的表达有恢复，即EV71感染引起的Jak1的下降可能依赖于溶酶体通路。本实验进一步探讨了EV71下调磷酸化STAT1和STAT2的机制。检测了细胞信号因子抑制蛋白（suppressor of cytokine signaling，SOCS），STAT激活的抑制蛋白（protein inhibitor of activated STATs，PIAS），酪氨酸磷酸酶蛋白（proteintyrosine phosphatases，PTP），结果显示这三种蛋白均不影响STAT1蛋白的磷酸化水平。在EV71的7个非结构蛋白中（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D），2A和3C是具有蛋白酶功能的蛋白，有文献报道EV71的2A通过减少IFNAR1的表达抑制I型干扰素信号通路，但本研究结果显示2A和3C均没有降低Jak1的表达以及抑制STAT1和STAT2的磷酸化。综上所述，本课题研究结果显示EV71感染宿主细胞后，通过下调Jak1蛋白水平，降低了Jak1和Tyk2的磷酸化水平，进而抑制STAT1和STAT2的磷酸化，并最终抑制I型干扰素信号通路。EV71感染引起的Jak1蛋白下降发生在蛋白水平，Jak1蛋白水平的下降可能依赖于自噬-溶酶体通路，其具体机制仍有待进一步研究。

全文目录

英文缩略语表  4-6
摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-16
第一章 EV71 测序、分型鉴定以及干扰素保护试验  16-24
  1 材料和方法  16-20
  2 结果  20-22
  3 讨论  22-24
第二章 EV71 对 I 型干扰素信号通路的影响  24-48
  第一节 EV71 感染对干扰素产生及 ISG 的影响  25-34
    1 材料和方法  25-31
    2 结果  31
    3 讨论  31-34
  第二节 EV71 抑制干扰素信号通路的研究  34-48
    1 材料和方法  34-39
    2 结果  39-44
    3 讨论  44-48
第三章 EV71 抑制干扰素信号通路的机制探讨  48-64
  第一节 Jak1 的下调可能依赖于溶酶体通路  49-55
    1 材料和方法  49-51
    2 结果  51-53
    3 讨论  53-55
  第二节 EV71 抑制 STAT1/2 磷酸化信号通路的机制探讨  55-59
    1 材料和方法  55-56
    2 结果  56-57
    3 讨论  57-59
  第三节 EV71 的 2A 和 3C 对干扰素信号通路的影响  59-64
    1 材料和方法  59-62
    2 结果  62
    3 讨论  62-64
结论  64-66
参考文献  66-74
附录主要溶液配制  74-76
文献综述  76-80
  参考文献  79-80
个人简历  80-81
致谢  81

EV71与干扰素相互作用的机理研究

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