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牦牛瘤胃微生物元基因组BAC文库的筛选与分析

作　者: 陈富荣
导　师: 刘丽华
学　校: 内蒙古工业大学
专　业: 化学工艺
关键词: 瘤胃元基因组细菌人工染色体(BAC)文库木质纤维素降解基因/基因簇
分类号: S823.85
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

反刍动物瘤胃是公认的木质纤维素高效降解的天然反应器,对瘤胃微生物的研究成为开发生物能源的热点领域之一。其研究手段已经从传统的依赖分离培养从瘤胃中获得木质纤维素降解菌,并对降解菌中的木质纤维素降解酶逐一分析,发展到通过基因组/元基因组技术,直接从瘤胃中发现获得大量新的木质纤维素降解酶基因/基因簇,进而探讨其降解的分子机理。元基因组BAC(Bacterial artificial chromosome)文库,具有能够容纳大插入片段的优势,近几年来受到广泛关注,通过构建大片段的元基因组BAC文库并对其进行筛选有可能获得大量新的基因/基因簇。建立了木质纤维素降解酶高通量筛选平台,可在3种不同底物的筛选平板上一次完成96个克隆的脂肪酶、木聚糖酶、纤维素酶和酯酶的活性筛选。采用该方法从已构建的牦牛瘤胃元基因组BAC文库的9600个克隆中筛选获得脂肪酶阳性克隆60个(0.625%),木聚糖酶阳性克隆123个(1.28%),纤维素酶阳性克隆156个(1.625%),酯酶阳性克隆101个(1.05%);其中具有2种酶活性的克隆79个,3种酶活性的克隆11个,表明文库中存在大量木质纤维素降解酶基因/基因簇。对4个木聚糖酶阳性克隆的测序结果进行分析,发现存在多种糖苷水解酶基因和调控基因,还发现一个可能的新木聚糖酶基因簇。为验证该基因簇的功能,对其中的部分基因在大肠杆菌中进行了克隆、表达、蛋白纯化及酶活性测定,研究结果证实该基因簇的ORF33基因、ORF34基因分别编码降解木聚糖主链的内切木聚糖酶、外切木聚糖酶/木糖苷酶,为进一步研究该基因簇的功能及其表达调控机理奠定了坚实的基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章引言  7-21
  1.1 瘤胃及其微生物  7-9
    1.1.1 研究瘤胃微生物的目的  8
    1.1.2 瘤胃微生物的研究简史  8-9
  1.2 瘤胃中木质纤维素降解菌及降解酶基因研究进展  9-16
    1.2.1 瘤胃中分离培养获得的木质纤维素降解菌及其降解酶  10-14
    1.2.2 瘤胃微生物的元基因组学研究  14-16
  1.3 木聚糖酶研究进展  16-18
  1.4 本课题研究的意义、目的及技术路线  18-21
第二章牦牛瘤胃微生物元基因组BAC 文库的筛选与分析  21-37
  2.1 实验材料与设备  21-24
    2.1.1 元基因组BAC 文库  21
    2.1.2 主要试剂和培养基  21-23
    2.1.3 主要仪器设备  23-24
  2.2 实验方法  24-26
    2.2.1 木质纤维素降解酶活性克隆筛选  24-25
    2.2.2 酶活阳性克隆的鉴定和测序  25-26
  2.3 实验结果  26-35
    2.3.1 木质纤维素降解酶活性克隆筛选结果  26-29
    2.3.2 酶活阳性克隆的插入片段分子量  29
    2.3.3 酶活阳性克隆限制性酶切图谱分析  29-30
    2.3.4 测序结果  30-35
  2.4 讨论  35-37
第三章木聚糖酶基因簇部分基因的克隆与表达  37-79
  3.1 实验材料与设备  37-42
    3.1.1 大肠杆菌菌株及载体  37
    3.1.2 主要试剂和培养基  37-41
    3.1.3 主要仪器设备  41-42
  3.2 实验方法  42-59
    3.2.1 木聚糖酶基因簇中 4 个基因的克隆  42-50
    3.2.2 木聚糖酶基因簇中基因的表达  50-53
    3.2.3 ORF33、ORF34 基因的表达及蛋白分离纯化  53-57
    3.2.4 ORF33、ORF34 蛋白纯化后酶活鉴定  57-59
  3.3 实验结果  59-78
    3.3.1 木聚糖酶基因簇中 4 个基因的克隆与表达  59-70
    3.3.2 ORF33、ORF34 蛋白纯化及酶活测定  70-78
  3.4 讨论  78-79
第四章结论  79-80
参考文献  80-85
附录  85-88
致谢  88-89
作者简介  89

牦牛瘤胃微生物元基因组BAC文库的筛选与分析

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