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十字花科蔬菜根肿病菌检测技术及畜禽粪便传播病原菌研究

作　者: 李金萍
导　师: 李宝聚
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 芸薹根肿菌休眠孢子荧光定量PCR Hoechest33342-PI复染法畜禽粪便传播途径
分类号: S436.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

十字花科蔬菜根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron）侵染引起的一种重要土传病害。近年来，十字花科蔬菜根肿病在我国云南、四川、湖北等主栽区大面积暴发流行，造成巨大的经济损失。本论文以十字花科蔬菜根肿病菌为研究对象，研究根肿病菌检测技术及畜禽粪便在根肿病菌传播过程中的作用。主要研究结果如下：1.创建了Hoechest33342-PI荧光双染检测新技术，检测不同介质中根肿菌休眠孢子活力。休眠孢子染色特征为，有活力的孢子发蓝色荧光，无活力孢子发红色荧光。最佳染色条件为，Hoechest33342的工作浓度为5μg/mL，染色的最佳时间为在37℃下孵育10min；PI的工作浓度为5μg/mL，染色时间为在4℃条件下染色15min。该技术适用于检测物理、射线及化学药剂作用引起的根肿菌休眠孢子失活，也可检测多种植物病原真菌活力，包括镰刀菌属(Fusarium)、葡萄孢属(Botrytis)、壳球孢属(Macrophomina)、疫霉属(Phytophthora)等17个属植物病原真菌。2.建立了十字花科蔬菜根肿病菌快速、高灵敏性检测技术。建立了基于根肿rDNA-ITS区序列的实时荧光定量PCR检测技术，最低检测限点为70个拷贝数/反应，相当于1000个休眠孢子·g-1土壤，其灵敏性比常规PCR至少高出2～3个数量级。采用蔗糖密度梯度离心法对样本中根肿菌休眠孢子进行富集，进一步提高了荧光定量PCR检测的灵敏性，检测限点为10个休眠孢子·g-1土壤，灵敏性较单独荧光定量PCR使用时提高了100倍。3.证明了畜禽粪便是十字花科蔬菜根肿病菌传播途径之一。采用荧光定量PCR技术检测带菌鸡粪及猪粪，平均带菌量分别为6.42×106个休眠孢子.g-1鸡粪和5.62×106个休眠孢子.g-1猪粪；Hoechst33342-PI复染法检测带菌鸡粪及猪粪中休眠孢子活力，有活力孢子比例分别为62.20%和68.89%；接种感病寄主植物后病情指数分别为47.22和52.78，三者结合证明了禽粪便可传播十字花科蔬菜根肿病菌。4.初步明确了畜禽消化道环境对根肿菌休眠孢子活力的影响。体外模拟畜禽消化道环境，评价高温（41℃和37℃）、高胆盐浓度（0.3%禽畜胆盐）、强酸环境（pH值2.0，3.0）处理后根肿菌休眠孢子存活率。根肿菌休眠孢子在鸡的消化道高温、高胆盐浓度及强酸作用后有活力孢子比例为53.24%，猪消化道环境作用后有活力休眠孢子比例为57.86%；接种感病寄主植物后病情指数分别为48.34和52.78，根肿菌休眠孢子对消化道的高温、高胆盐浓度及强酸环境具有很强的耐受性。5.采用高温堆肥技术可以杀灭带菌猪粪中的根肿菌，实现根肿菌无害化处理。整个堆肥过程中共进行2次发酵，温度均维持在55～68℃之间，持续时间均为10d左右，水分含量在55%左右，整个堆肥过程中堆体温度和水分含量有利于杀死根肿菌休眠孢子，在堆肥进行40d时可以完全杀死猪粪中的根肿菌休眠孢子，无活力孢子比例为100%，接种感病寄主植物不发病。发酵结束时堆肥pH值为8.32，呈微碱性适于农作物生长；毒素敏感植物种子的发芽率超过90%，完全符合植物生长的要求，对植物生长无抑制作用。本研究创建了Hoechest33342-PI荧光双染检测技术，用于检测不同介质中根肿菌休眠孢子活力，首次将荧光双染技术应用到植物病原菌活力检测领域，可为植物病原菌活力、致病力检测及杀菌剂活性筛选提供了新的技术手段；建立了十字花科蔬菜根肿病菌快速高灵敏性检测技术。该技术为进一步研究根肿病的流行规律及早期诊断和监测提供了理论依据和有效的技术手段。同时，通过体外模拟技术初步明确了畜禽粪便传播根肿病菌的机制，证明了畜禽粪便是十字花科蔬菜根肿病的传播途径之一。通过高温堆肥技术实现了猪粪中根肿菌无害化处理，该研究结果为根肿病防治策略的制定提供理论依据及技术支持。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章引言  14-28
  1.1 根肿病的研究概况  14-18
    1.1.1 芸薹根肿菌的分类地位及生活史  14-15
    1.1.2 根肿菌形态及生物学特性  15-16
    1.1.3 根肿菌寄主范围及侵染途径  16-17
    1.1.4 根肿病发病规律及传播途径  17-18
    1.1.5 根肿病的危害  18
  1.2 荧光染色技术在植物病原菌活力检测研究中的应用  18-20
    1.2.1 病原菌活性检测技术研究进展  19-20
    1.2.2 荧光染色技术在根肿菌活力检测研究中的应用  20
  1.3 PCR 快速检测技术研究进展及应用  20-23
    1.3.1 PCR 快速检测技术研究进展  20-22
    1.3.2 PCR 快速检测技术在根肿菌检测中的应用  22-23
  1.4 高温堆肥发酵技术在植物病害防治中的应用  23-25
    1.4.1 高温堆肥发酵技术影响因素  23-24
    1.4.2 高温堆肥技术在植物病害防治中的应用  24-25
  1.5 本研究的目的及意义  25-26
  1.6 论文主要研究内容和技术路线  26-28
    1.6.1 研究内容  26-27
    1.6.2 技术路线  27-28
第二章芸薹根肿菌休眠孢子活力检测技术研究  28-48
  2.1 试验材料  28-29
  2.2 试验方法  29-33
  2.3 结果与分析  33-45
    2.3.1 肿根及土壤中根肿菌休眠孢子的分离与富集  33-34
    2.3.2 荧光染色方法的筛选  34-36
    2.3.3 最佳染色技术参数研究  36-37
    2.3.4 最佳染色技术有效性评价  37-42
    2.3.5 Hoechest33342-PI 复染法应用  42-45
  2.4 小结与讨论  45-48
    2.4.1 根肿菌休眠孢子活力检测方法筛选  45
    2.4.2 最佳染色技术参数研究  45
    2.4.3 最佳染色技术有效性评价  45-46
    2.4.4 Hoechst333342-PI 复染法的应用  46-48
第三章根肿病菌快速高灵敏性检测技术的建立及应用  48-64
  3.1 试验材料  48-50
  3.2 试验方法  50-54
  3.3 结果与分析  54-62
    3.3.1 病原菌基因组 DNA 的提取  54-55
    3.3.2 芸薹根肿菌 ITS 区序列测定及特异性引物设计  55
    3.3.3 引物特异性检测  55
    3.3.4 荧光定量 PCR 标准品的制备  55-56
    3.3.5 荧光定量 PCR 标准曲线的建立  56-57
    3.3.6 荧光定量 PCR 体系灵敏性及重复性评价  57-59
    3.3.7 荧光定量 PCR 检测技术的应用  59-62
  3.4 小结与讨论  62-64
    3.4.1 荧光定量 PCR 检测体系的特异性、灵敏性及重复性评价  62-63
    3.4.2 荧光定量 PCR 检测体系的应用  63-64
第四章禽畜粪便传播十字花科蔬菜根肿病菌研究  64-76
  4.1 试验材料  64-65
  4.2 试验方法  65-67
  4.3 结果与分析  67-74
    4.3.0 荧光定量 PCR 检测鸡粪及猪粪中的根肿菌  67-68
    4.3.1 鸡粪及猪粪中根肿菌休眠孢子的分离  68-69
    4.3.2 Hoechest33342-PI 复染法检测根肿菌休眠孢子活力  69-72
    4.3.3 带菌鸡粪和猪粪中根肿菌休眠孢子致病性测定  72-74
  4.4 小结与讨论  74-76
    4.4.1 鸡粪及猪粪中根肿菌的荧光定量 PCR 检测  74-75
    4.4.2 鸡粪及猪粪中根肿菌休眠孢子活力及致病力评价  75-76
第五章模拟畜禽消化道环境对根肿菌活力影响研究  76-83
  5.1 试验材料  76
  5.2 试验方法  76-78
  5.3 结果与分析  78-81
    5.3.1 根肿菌休眠孢子耐热性评价  78-79
    5.3.2 根肿菌休眠孢子耐酸性评价  79-80
    5.3.3 根肿菌休眠孢子耐胆盐性评价  80-81
    5.3.4 体外模拟处理后根肿菌休眠孢子致病力评价  81
  5.4 小结与讨论  81-83
    5.4.1 根肿菌休眠孢子具有很强的耐热性  81-82
    5.4.2 根肿菌休眠孢子对强酸和高胆盐浓度具有很强的耐受性  82-83
第六章带菌猪粪中根肿菌无害化处理技术研究  83-94
  6.1 试验材料  83-84
  6.2 试验方法  84-85
  6.3 结果与分析  85-91
    6.3.1 堆体温度、氧浓度、水分变化  85-88
    6.3.2 高温堆肥 pH 值和电导率(EC)的变化  88-89
    6.3.3 高温堆肥腐熟度指标参数测试及分析方法  89-90
    6.3.4 高温堆肥对根肿菌灭杀效果评价  90-91
  6.4 小结与讨论  91-94
    6.4.1 堆体温度和水分变化对根肿菌休眠孢子活力影响  91-92
    6.4.2 堆体 pH 值对根肿菌休眠孢子活力影响  92
    6.4.3 堆体腐熟度评价  92-93
    6.4.4 高温堆肥对根肿菌灭杀效果  93-94
第七章结论与讨论  94-103
  7.1 全文结论  94-96
    7.1.1 创建了根肿菌休眠孢子荧光双染新技术  94
    7.1.2 建立了根肿病菌快速高灵敏性检测技术  94-95
    7.1.3 畜禽粪便是十字花科蔬菜根肿病传播途径之一  95
    7.1.4 初步明确了畜禽消化道环境对根肿菌休眠孢子活力的影响  95
    7.1.5 实现了带菌猪粪中根肿菌休眠孢子的无害化处理  95-96
  7.2 讨论  96-101
    7.2.1 十字花科蔬菜根肿病防控中存在的问题  96-97
    7.2.2 根肿菌休眠孢子活力检测技术研究  97-98
    7.2.3 根肿菌荧光定量 PCR 检测技术的应用  98-99
    7.2.4 畜禽粪便带菌是根肿病大面积暴发与流行的重要原因  99-101
    7.2.5 猪粪中根肿菌无害化处理技术研究  101
  7.3 论文创新点  101-102
  7.4 展望  102-103
参考文献  103-115
致谢  115-116
作者简历  116

十字花科蔬菜根肿病菌检测技术及畜禽粪便传播病原菌研究

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